江蘇地區(qū)嗜水氣單胞菌分離鑒定、分子分型及弱毒株生物學(xué)特性分析.pdf

1、嗜水氣單胞菌（Aeromonashydrophila）普遍存在于淡水、土壤、人畜糞便等各種環(huán)境中，有致病菌株和非致病菌株之分。致病菌株可引起多種水產(chǎn)動(dòng)物的敗血癥以及畜禽和人類腹瀉，尤其在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)上危害嚴(yán)重。因此，了解嗜水氣單胞菌的流行情況及流行菌株的致病性就顯得格外重要。
　　 為了研究嗜水氣單胞菌在江蘇地區(qū)的流行情況，從水體環(huán)境和魚體中共采集樣品169份，其中分離鑒定出嗜水氣單胞菌菌株41株（占24.3％），說明該菌在自然環(huán)

2、境中分布廣泛，水體和魚中均有分布。選取嗜水氣單胞菌的5種主要胞外毒力因子氣溶素（aer）、細(xì)胞毒性腸毒素（act）、和細(xì)胞興奮性腸毒素（alt）、溫敏胞外蛋白酶（eprCAI）、絲氨酸蛋白酶（ahp），設(shè)計(jì)并合成5對(duì)引物，對(duì)41株分離株進(jìn)行PCR檢測(cè)，了解嗜水氣單胞菌毒力因子的分布情況。結(jié)果顯示aer和ahp的檢出率較高，分別為80.5％和78.0％；act和alt的檢出率為65.9％和61.0％；eprCAI的檢出率最低，為39.0％

3、；5種毒力因子均含有的占17.1％，均不合有的占4.88％。可見氣溶素和絲氨酸蛋白酶在嗜水氣單胞菌分布非常廣泛，是最主要的毒力因子之一，而溫敏胞外蛋白酶則在嗜水氣單胞菌中分布較少，且大部分分離株能檢測(cè)出毒力因子。從以上結(jié)果可以看出嗜水氣單胞菌的毒力因子分布較廣，具有潛在的致病性。
　　 采用ERIC-PCR和RAPD兩種分型方法對(duì)嗜水氣單胞菌09年分離菌株及實(shí)驗(yàn)室保存菌株共84株進(jìn)行基因分型。參考相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)并合成引物，分別進(jìn)行

4、PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果經(jīng)QuantityOne軟件數(shù)值化后利用SPSS軟件進(jìn)行聚類分析。結(jié)果顯示84株嗜水氣單胞菌均能得到多態(tài)性較好的指紋圖譜。ERIC-PCR能擴(kuò)增出4至16個(gè)大小在100bp到58001bp之間的條帶，把84株嗜水氣單胞菌分為4群和17類，不同年代，不同地理位置分別有聚成一類的趨勢(shì)。RAPD兩種不同引物能擴(kuò)增出1至12個(gè)大小在200bp到4500bp之間的條帶，分別把84株嗜水氣單胞菌分為4群、12類和

5、3群、19類。兩種分型方法均體現(xiàn)很好的分型能力。但ERIC-PCR分型相比RAPD分型，重復(fù)性和穩(wěn)定性更好，分辨力更高，且具備RAPD不要求模板序列已知而直接進(jìn)行擴(kuò)增的優(yōu)點(diǎn)，更適合嗜水氣單胞菌的分型研究。
　　 在嗜水氣單胞菌的5種主要胞外毒力因子氣溶素（aer）、細(xì)胞毒性腸毒素（act）、和細(xì)胞興奮性腸毒素（alt）、溫敏胞外蛋白酶（eprCAI）、絲氨酸蛋白酶（ahp）檢測(cè)基礎(chǔ)上，選取毒力基因少的3個(gè)代表菌株（NJ-4、NJ

6、13、CS-13）進(jìn)行溶血性、溶蛋白性、細(xì)胞毒性的測(cè)定、粘附試驗(yàn)、主要外膜蛋白（MOMP）圖譜分析及斑馬魚致病性試驗(yàn)。結(jié)果顯示：3個(gè)菌株均不溶血、不溶蛋白；NJ-4和CS-13均不使細(xì)胞產(chǎn)生病變，NJ13能致細(xì)胞病變；NJ-4沒有細(xì)胞粘附能力，NJ13、CS-13則有一定的細(xì)胞黏附能力，但與強(qiáng)毒株BSK-10相比，黏附能力較弱；NJ-4Y、CS-13的MOMP條帶與BSK-10相似度很高，而與NJ13有一定差別；NJ-4、NJ13和CS