單增李斯特菌弱毒株M7膜裂解因子的表達調(diào)控及其對細菌致病力的影響.pdf

1、單核細胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes，單增李斯特菌)是一種重要的食源性病原菌，能引起李斯特菌病，表現(xiàn)為胃腸炎、敗血癥、髓膜炎、腦炎等。該病在孕婦、老人及免疫力低下人群中多發(fā)，雖發(fā)病率不高，但死亡率高達30％。單增李斯特菌為革蘭氏陽性短桿菌，在自然環(huán)境中廣泛存在；當其進入宿主體內(nèi)后，能迅速完成角色轉(zhuǎn)換，成為胞內(nèi)寄生菌。該菌在宿主體內(nèi)的增殖、擴散都在細胞質(zhì)中完成，而建立感染的前提是菌體在膜裂解因子的作用下逃離

2、吞噬小體。本文旨在研究主要膜裂解因子李斯特菌溶血素(LLO，由hly編碼)與廣譜磷脂酶C(PC-PLC，由plcB編碼)在分離自消毒奶的弱毒株M7中的表達調(diào)控狀況，及其對M7菌株致病力的影響。
　　 通過點突變技術(shù)構(gòu)建了兩株針對plcB5’UTR區(qū)域及ORF第1位的突變株，發(fā)現(xiàn)其溶脂活性均消失，plcB基因在M7-plcB-m1和M7-plcB-m2中的轉(zhuǎn)錄水平分別是親本株M7的13.8％和27.6％，表明PC-PLC對菌株M7

3、強溶脂活性具有重要作用，且其編碼基因5’UTR區(qū)域也對該表型有影響。利用Tn917篩選出兩株溶脂活性消失的轉(zhuǎn)座突變體，轉(zhuǎn)座子插入位點分別在prfA ORF內(nèi)和P1啟動子中。這兩株插入突變體的主要毒力基因(包括plcB、hly等)轉(zhuǎn)錄水平均低于親本株(P<0.05或P<0.01)，表明PrfA對主要毒力因子發(fā)揮重要調(diào)控作用。
　　 利用同源重組技術(shù)構(gòu)建hly與plcB單缺失與雙缺失突變株。乳酸脫氫酶(LDH)試驗表明，在相同MOI

4、條件下，M7及plcB單缺失株對Caco-2細胞毒性達86.8％和83.2％，hly單缺失株與hly-plcB基因雙缺失株的細胞毒性僅為23.5％和11.1％。由此可見，LLO(hly)對Caco-2細胞毒性作用具有決定性作用。但雙缺失株對小鼠毒力(LD50>107.95)與親本株(LD50=107.46)相似。表明LLO介導細胞毒性且與致病性有關(guān)，但是其強溶血性和細胞毒性并非M7菌株弱毒的機制。
　　 通過對M7和強毒株EGD

5、中PrfA氨基酸序列分析，發(fā)現(xiàn)3個差異位點，分別為145、165與197位。據(jù)此構(gòu)建兩株以EGD prfA替換M7相應(yīng)ORF的突變株，其中一株仍保留親本株P(guān)rfA第197位的氨基酸。這兩株突變株的體外溶脂活性均消失，溶血活性顯著低于親本株(P<0.01)，表明了PrfA對PC-PLC和LLO的調(diào)控作用。雖然兩株突變株(M7-EGDprfA-1和M7-EGDprfA-2)的毒力因子轉(zhuǎn)錄水平均顯著低于M7(P<0.01)而與EGD相仿(P>

6、0.05)，但其對小鼠的毒力(LD50為105.12和104.64)仍低于EGD(LD50為101.99)。表明除PrfA、LLO和PC-PLC外，M7菌株中可能還存在其它因子與其弱毒有關(guān)。
　　 本研究為進一步探明膜裂解因子LLO和PC-PLC在弱毒株M7中的表達、調(diào)控及其對細菌致病力的影響提供了許多有用的突變體，并做了大量前期工作：(1)M7菌株plcB的5’-UTR區(qū)域影響其PC-PLC的表達，從而影響該菌株體外強溶脂活性