青枯勞爾氏菌PopW蛋白生物學(xué)特性及其抗病功能研究.pdf

1、細(xì)菌性青枯病是一種由青枯勞爾氏菌(Ralstonia solaanacearum， E F Smith)引起的毀滅性土傳病害，發(fā)病植物莖葉萎蔫下垂直至全部枯死，是世界上危害最大、分布最廣、造成損失最嚴(yán)重的植物病害之一。青枯勞爾氏菌R.solaanacearum可侵染200多種植物，其中包括生產(chǎn)中重要的作物，如番茄、馬鈴薯、煙草、花生和香蕉。青枯病菌是一個復(fù)雜的群體，有明顯的生理分化，不同地區(qū)和不同寄主來源的菌株，在寄主范圍、致病力、生化

2、型、血清型等細(xì)菌學(xué)特性上差異很大，因此增加了對此病害防治的難度。近幾年來許多科研工作者從不同角度、用不同方法對青枯勞爾氏菌進(jìn)行了多方面的研究。
　　 Harpin蛋白是由革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌Hrp(hrp, hypersensitive response and pathogenity)基因簇中hrp基因編碼的、性質(zhì)和功能相似的一類蛋白質(zhì)，富含甘氨酸，缺少半胱氨酸，對蛋白酶敏感，對熱穩(wěn)定，大多對寄主植物具有毒性，導(dǎo)致寄主發(fā)病，

3、能在非寄主植物上引起過敏反應(yīng)。
　　 本研究以青枯勞爾氏菌(Ralstonia solanacearum）ZJ3721的基因組DNA為模板，成功克隆了全長為1143bp的popW基因以及popW(1-159)和popW(160-366)兩個基因片段，并把這三個基因連接到表達(dá)載體pET30a(+)進(jìn)行了原核表達(dá)。在1mM異丙基硫代-β-D-半乳糖昔的誘導(dǎo)下(IPTG)，這三個基因都能在Escherichia coli BL21(D

4、E3)中成功表達(dá)。通過對PopW表達(dá)條件的優(yōu)化發(fā)現(xiàn)IPTG的最佳濃度為0.01 mM。運用鎳柱純化獲得了高純度的PopW融合蛋白。另外運用同源重組的方法我們還構(gòu)建了青枯勞爾氏菌popW基因的插入突變體ZJ3722.
　　 我們從青枯勞爾氏菌ZJ3721中鑒定了一個39.79 KDa的新胞外蛋白PopW，它同以前報道的harpin類物質(zhì)具有相同的性質(zhì)，酸性，富含甘氨酸和絲氨酸，缺少半胱氨酸并且是一種耐熱蛋白。能在非寄主植物煙草上引

5、起過敏性反應(yīng)。在一級結(jié)構(gòu)上，PopW是由兩個結(jié)構(gòu)域組成，包括N-末端159個氨基酸的harpin結(jié)構(gòu)和C-末端207個氨基酸組成的果膠酶的結(jié)構(gòu)域，他們之間由富含甘氨酸和絲氨酸的短肽連接起來。PopW的harpin結(jié)構(gòu)域也能引起煙草發(fā)生HR反應(yīng)。雖然PopW具有果膠酶結(jié)構(gòu)域，但并沒有果膠酶活性。另外，我們從其它十九個不同遺傳多樣性的青枯勞爾氏菌中都擴(kuò)增到了popW基因，這說明popW是廣泛存在于青枯勞爾氏菌的。把popW和綠色熒光蛋白(G

6、FP)構(gòu)成融合基因，連接至植物轉(zhuǎn)基因載體pBI121,在土壤桿菌的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞。熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明，PopW蛋白是定位在植物的細(xì)胞壁上。因此，我們推測PopW在青枯勞爾氏菌與寄主互作的過程中起幫助定殖的作用。通過popW的缺失突變體菌株的接種實驗發(fā)現(xiàn)popW對非寄主植物煙草的HR反應(yīng)和寄主植物的致病過程中不起決定作用。綜上所述，PopW(39.79 KDa)是青枯勞爾氏菌中廣泛存在的一個定位于寄主細(xì)胞壁上，受hrpB基因的

7、調(diào)控，通過三型泌出系統(tǒng)分泌到胞外的且不影響菌株對寄主致病性的新harpin。
　　 對青枯勞爾氏菌(Ralstonia solanacearum)ZJ3721中表達(dá)的PopW蛋白誘發(fā)煙草系統(tǒng)獲得抗性進(jìn)行了研究。以25μg/mL PopW溶液處理三生煙草葉片24 h后，在處理葉片及其上、下各2片葉片接種TMV，結(jié)果顯示處理葉及其上、下各2片葉片上的病斑數(shù)顯著少于只接種水和TMV的對照葉片。同時PopW處理的煙草葉片中還伴隨著H2O

8、2的迸發(fā)，在處理后24h時，累積量達(dá)到了最大為1.972μM/gFW。另外在此過程中，煙草中還有防御酶系PAL， POD和PPO的時序變化，PAL酶活在12h達(dá)到了峰值1215.33U/g， POD和PPO在24h和10h到達(dá)了最大值，分別是1110.5U/g和863.67U/g。PopW還能誘導(dǎo)野生型煙草和擬南芥中PR-1基因的表達(dá)，而二者轉(zhuǎn)nahG基因的突變體植株卻沒有該基因的表達(dá)。所以PopW能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，并且該抗性屬

9、于水楊酸介導(dǎo)的SAR。
　　 茄子黃萎病是一種嚴(yán)重的土傳維管束病害，本研究發(fā)現(xiàn)PopW蛋白能夠誘導(dǎo)茄子產(chǎn)生抗性從而防止黃萎病菌的侵染。同時我們從353株茄子根圍細(xì)菌中篩選到一株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的生防細(xì)菌CH2。根據(jù)16S rRNA基因序列和生理生化實驗確定其為蠟狀芽孢桿菌。它能在以幾丁質(zhì)為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長，經(jīng)SDS-PAGE和特異性底物驗證確定其可以向胞外為分泌15KDa的幾丁質(zhì)酶。通過平板實驗我們發(fā)現(xiàn)，該菌的懸浮液、上清液及其