鴨疫里默氏菌感染耐過(guò)鴨血清免疫生物學(xué)活性研究.pdf

1、鴨疫里默氏菌（Riemerellaanatipestifer，RA）為革蘭氏陰性、短桿菌，是鴨、鵝、火雞等禽類(lèi)傳染性漿膜炎(infectiousserocitis，IS)的病原，存在至少21種血清型。類(lèi)似于RA菌落形態(tài)和生化特征的細(xì)菌很多。根據(jù)16SrDNA將這些細(xì)菌歸屬于黃桿菌科（Flavobacterius）里默氏屬（Riemerella），并細(xì)分為鴨疫里默氏菌種（Riemerellaanatipestifer，RA）和哥倫比亞里默

2、氏菌種(Riemerellacolumbina，RC)。鴨IS是鴨的常發(fā)病、多發(fā)病，8周齡內(nèi)鴨高度易感，發(fā)病率為80％～100％，死亡率30％～70％。1、2、5等血清型是引起鴨IS主要流行血清型。雖然滅活疫苗和活疫苗可以有效地預(yù)防控制鴨IS流行，但是，目前我國(guó)養(yǎng)鴨場(chǎng)鴨IS流行仍然較為嚴(yán)重。如果我國(guó)政府進(jìn)一步加大抗菌素藥物在肉鴨養(yǎng)殖中的禁用力度，該病流行將會(huì)更加嚴(yán)重，養(yǎng)鴨業(yè)將蒙受巨大經(jīng)濟(jì)損失。究其原因有，不同血清型RA菌株缺乏交叉免疫保

3、護(hù)，滅活疫苗免疫誘導(dǎo)長(zhǎng)（10-14天），血清型變異快，耐藥性產(chǎn)生迅速等。本文報(bào)道RA抗體定量檢測(cè)方法和耐過(guò)鴨血清被動(dòng)免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果，旨在快速準(zhǔn)確診斷流行血清型，為疫苗研制和使用提供監(jiān)測(cè)技術(shù)，進(jìn)一步明確鴨SI的免疫保護(hù)機(jī)制，為改進(jìn)疫苗效果，尤其是研制可避免血清型差異的通用型疫苗提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。
　　1AF株
　　AF株系從鴨自然病例中分離的一株強(qiáng)毒力細(xì)菌，經(jīng)玻板凝集鑒定為RA血清2型，16SrDNA和協(xié)同溶血素（cohem

4、olysin,camp）基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1480bp和596bp，序列分析結(jié)果均證實(shí)屬于RA，用于本研究。
　　2.改良微量凝集試驗(yàn)可用于鴨SI快速診斷流行血清型
　　凝集試驗(yàn)（agglutinationtest，AT）是經(jīng)典免疫血清學(xué)技術(shù)。玻板AT廣泛用于RA血清型定性鑒定。微量凝集(Microagglutinationtest，MAT)以96孔‘V’型PVC板為載體，主要用于RA血清抗體效價(jià)定量檢測(cè)。常規(guī)MAT存在凝集

5、與未凝集結(jié)果判定困難，檢測(cè)結(jié)果敏感性不高等問(wèn)題。改良MAT方法是，RA以兔血巧克力LB平板培養(yǎng)，生理鹽水(PS)懸浮細(xì)菌，0.5％甲醛滅活，復(fù)紅染色即制成MAT抗原。反應(yīng)總體積為50μL。采取斜立近乎垂直觀(guān)察‘下滑線(xiàn)’區(qū)別凝集與未凝集現(xiàn)象。改良MAT檢測(cè)結(jié)果是，健康非免鴨76.5％個(gè)體抗體效價(jià)為0，其余為1log2;滅活疫苗免疫后14-22天血清抗體效價(jià)為2～5log2，70％個(gè)體為效價(jià)為2～3log2。攻毒后，疫苗免疫組無(wú)發(fā)病，但抗體

6、效價(jià)于第2天上升1-2個(gè)滴度，即效價(jià)范圍為2～5log2。未接種疫苗的攻毒對(duì)照組100％發(fā)病，有20％～90％的死亡率，攻毒后7天存活的耐過(guò)鴨效價(jià)范圍為3～8log2，超過(guò)5log2的個(gè)體比例占73.9％。研究結(jié)果提示，改良MAT背景值低于1log2，滅活疫苗免疫鴨效價(jià)低于5log2，而感染發(fā)病后的耐過(guò)鴨血清效價(jià)大于5log2的比例很高。據(jù)此提出，耐過(guò)鴨群檢測(cè)MAT效價(jià)可以快速診斷流行的RA血清型。
　　3.RA感染耐過(guò)鴨非凝集類(lèi)

7、抗體是主要免疫保護(hù)抗體
　　22日齡易感鴨隨機(jī)分為4組，分別注射健康鴨血清、RA感染耐過(guò)鴨血清、RA滅活疫苗免疫后攻毒發(fā)病耐過(guò)鴨（下簡(jiǎn)稱(chēng)免疫攻毒耐過(guò)鴨）血清和PS，每只3.0mL，24h后攻毒。結(jié)果是，PS組和健康鴨血清組100％發(fā)病，死亡率(mortality，Mt)分別為56％(5/9)和20％(1/5)，耐過(guò)鴨血清組無(wú)發(fā)病、無(wú)死亡，免疫攻毒鴨血清組發(fā)病20％(1/5)，無(wú)死亡。重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果是，PS組和健康血清組100％發(fā)病，

8、Mt為37.5％(5/14)和60％(3/5)，耐過(guò)鴨血清組無(wú)發(fā)病、無(wú)死亡，免疫攻毒鴨血清組發(fā)病100％(5/5)，無(wú)死亡。結(jié)果表明，RA感染耐過(guò)鴨血清具有良好的免疫保護(hù)效果。
　　混合耐過(guò)鴨血清（MAT效價(jià)為5log2）56℃水浴30min處理、活菌菌體抗原吸附4-5次除去凝集抗體（MAT檢測(cè)效價(jià)為0）并56℃水浴30min處理及稀釋4倍（MAT檢測(cè)為3log2）注射1mL/只(劑量為其他組的1/3)發(fā)病率分別為0、0和22.2

9、％(2/9)，Mt均為0，即無(wú)死亡。同時(shí)設(shè)置的PS組和健康鴨血清組100％發(fā)病，Mt為33.3％(3/9)和0％。結(jié)果顯示，RA耐過(guò)鴨血清中的非凝集性抗體為主要保護(hù)性抗體，且生物活性高，不受56℃水浴30min影響。MAT效價(jià)與被動(dòng)免疫保護(hù)效果存在間接相關(guān)性。
　　4.AF株生長(zhǎng)凝集-解凝集生長(zhǎng)現(xiàn)象
　　RA耐過(guò)鴨血清（MAT效價(jià)為6log2）無(wú)菌檢驗(yàn)合格后，取100μL加入1.9mLLB肉湯中，培養(yǎng)AF株。觀(guān)察到，接種后2

10、h，出現(xiàn)小的絮狀凝集塊，溶液透明，4-5h凝集塊最多，呈大片狀，溶液透明，5-6h凝集塊開(kāi)始解散，溶液變?nèi)榘咨?-7h后凝集塊完全消失，溶液渾濁快速增加。測(cè)定A525值發(fā)現(xiàn)，凝集塊消散后，數(shù)值呈對(duì)數(shù)增加，至12h達(dá)最大值，即2.2以上。凝集塊的出現(xiàn)與MAT效價(jià)有關(guān)，低于4log2的血清試管，凝集塊模糊。健康鴨血清對(duì)照組未見(jiàn)凝集塊出現(xiàn)，但細(xì)菌生長(zhǎng)至12h時(shí)，A525也達(dá)峰值。無(wú)鴨血清的LB組，細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，A525峰值出現(xiàn)在24h左右。

11、結(jié)果表明，耐過(guò)鴨血清組出現(xiàn)的凝集塊具有特異性，鴨血清對(duì)RA的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。本文將RA一邊生長(zhǎng)并同時(shí)與抗體發(fā)生特異凝集反應(yīng)，之后凝集塊消散，細(xì)菌快速生長(zhǎng)現(xiàn)象歸納為生長(zhǎng)凝集-解凝集生長(zhǎng)(growthagglutinationanddeagglutinationgrowth，GADAG)現(xiàn)象。RA發(fā)生這一新現(xiàn)象的機(jī)制尚待研究。
　　GADAG過(guò)程中細(xì)菌鏡檢形態(tài)發(fā)生變化。在凝集期，AF株聚集成塊，菌體形態(tài)變短，幾近球形。凝集塊消散后，