豬圓環(huán)病毒2型感染PK-15細(xì)胞差異蛋白質(zhì)組研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type2，PCV2)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員，基因組為單鏈環(huán)狀DNA。PCV2病毒基因組已經(jīng)證明三個(gè)能夠編碼蛋白質(zhì)ORF為：ORF1編碼復(fù)制相關(guān)蛋白(Rep)，ORF2編碼衣殼蛋白(Cap)，以及ORF3編碼ORF3蛋白。PCV2對(duì)豬的致病性主要體現(xiàn)在免疫抑制。本研究對(duì)PCV2感染PK-15細(xì)胞的差異表達(dá)蛋白及與PK-15細(xì)胞蛋白間相互作用進(jìn)行分析，旨在探討PCV2在PK-15

2、細(xì)胞的復(fù)制與感染機(jī)制。
　　 1、PCV2感染性克隆的構(gòu)建
　　 在自然感染PCV2豬群中，豬體能夠同時(shí)感染多種亞型的PCV2。對(duì)不同基因型的PCV2致病性進(jìn)行研究，需要獲得純化的PCV2病毒。為了獲得純化的PCV2病毒，本研究通過克隆病毒全長(zhǎng)基因組，并利用感染性克隆構(gòu)建技術(shù)進(jìn)行病毒遺傳拯救以及拯救病毒的細(xì)胞培養(yǎng)特性測(cè)定，試驗(yàn)證明拯救的病毒與野生型病毒具有相似的復(fù)制能力。獲得純化的PCV2病毒為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

3、　　 2、PCV2感染PK-15細(xì)胞后差異表達(dá)蛋白鑒定
　　 用遺傳拯救的PCV2病毒粒子感染PK-15細(xì)胞，應(yīng)用二維凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜鑒定對(duì)感染的PK-15細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。二維凝膠電泳數(shù)據(jù)分析顯示，在PCV2感染PK-15細(xì)胞后，共有61個(gè)差異表達(dá)蛋白被發(fā)現(xiàn)。差異表達(dá)蛋白主要出現(xiàn)在PCV2感染PK-15細(xì)胞后48-96h。經(jīng)過MALDI-TOF/TOF鑒定，共有44個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)獲得成功鑒定，包括22個(gè)上調(diào)表達(dá)蛋白點(diǎn)

4、和22個(gè)下調(diào)表達(dá)蛋白點(diǎn)。22個(gè)上調(diào)表達(dá)蛋白點(diǎn)代表的18種蛋白是：蛋白酶體亞單位p40、NUP43蛋白、Ras相關(guān)蛋白R(shí)ap-2c、抑制素、3種肌動(dòng)蛋白、微管蛋白、微絲相關(guān)蛋白、抗氧化蛋白4、抗氧化蛋白6、空泡離子泵亞單位B2、蛋白質(zhì)磷酸激酶2亞型8、精氨酸脫亞氨酸酶、丙酮酸脫氫酶E1β亞基、異檸檬酸脫氫酶、酸性核蛋白體磷蛋白PO、酪氨酰tRNA合成酶。22個(gè)下調(diào)表達(dá)蛋白點(diǎn)代表的22種蛋白是：網(wǎng)素、中間絲相關(guān)蛋白、熱休克蛋白27、延伸因子

5、2、復(fù)制蛋白A2、嘌呤核苷磷酸化酶、鳥嘌呤單核苷酸合成酶、次黃嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶、三聯(lián)組氨酸、醛醇基轉(zhuǎn)移酶、半乳糖變旋光酶，肽基異構(gòu)酶、異檸檬酸脫氫酶、α烯醇化酶、6磷酸葡萄糖酸內(nèi)脂酶、磷酸葡萄糖變位酶、3'磷酸腺苷5'磷酸硫酸合成酶、蛋白酶體β3亞基、蛋白酶體激活復(fù)合物亞基1、SKP1等位基因G2抑制劑、SH2/SH3銜接蛋白、同源異形盒前圓蛋白。上調(diào)蛋白與細(xì)胞骨架、生物合成、脂蛋白代謝、泛素蛋白酶體途徑、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因調(diào)控相關(guān)。下調(diào)

6、蛋白與蛋白的轉(zhuǎn)錄和延伸、RNA的加工和合成、糖降解、氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、泛素蛋白酶體途徑、信號(hào)轉(zhuǎn)到、基因調(diào)控相關(guān)。利用real time RT-PCR方法，在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)質(zhì)譜鑒定的20種差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明差異表達(dá)蛋白轉(zhuǎn)錄本變化與二維凝膠電泳中的變化趨勢(shì)呈部分一致。利用已有的單克隆抗體工具，借助Western Blot進(jìn)一步驗(yàn)證了細(xì)胞的β-actin、α-tubulin以及cytokeratin8，結(jié)果表明α-tubulin以

7、及cytokeratin8兩種蛋白的變化趨勢(shì)與二維電泳中兩種蛋白點(diǎn)變化趨勢(shì)一致。綜上所述，PCV2感染PK-15細(xì)胞以后，引起細(xì)胞內(nèi)骨架相關(guān)蛋白、應(yīng)激反應(yīng)蛋白、生物合成相關(guān)蛋白、泛素蛋白酶體相關(guān)蛋白、信號(hào)轉(zhuǎn)到和基因調(diào)控相關(guān)蛋白的變化。
　　 3、PCV2衣殼蛋白與PK-15細(xì)胞蛋白α-tubulin相互作用的鑒定
　　 病毒編碼蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布決定病毒復(fù)制的部位，為了鑒定PCV2編碼蛋白R(shí)ep和Cap在細(xì)胞內(nèi)的亞胞定位

8、，本試驗(yàn)通過構(gòu)建Rep和Cap蛋白的重組真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞以及PCV2病毒粒子感染PK-15細(xì)胞進(jìn)行研究，結(jié)果顯示：Rep蛋白在感染后24h、48h定位在細(xì)胞核中，在72h少量Rep蛋白出現(xiàn)在細(xì)胞漿中。PCV2 Cap蛋白在感染后的24h定位在細(xì)胞核中，而48h和72h定位在細(xì)胞漿中。這表明PCV2在PK-15細(xì)胞復(fù)制過程中出現(xiàn)了Rep和Cap蛋白位移現(xiàn)象。細(xì)胞骨架對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸具有重要作用，基于蛋白組學(xué)發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞骨架