禽波氏桿菌OMP單克隆抗體的制備及其生物學(xué)特性研究.pdf

1、禽波氏桿菌病是由禽波氏桿菌(Bordetella avium，B.avium)引起的一種高度接觸傳染性疫病。近年來的研究表明該病在不同地區(qū)的雞群中感染率為10％～50％，患病雞群多數(shù)生長遲緩，飼料報酬低，對家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了較大的經(jīng)濟損失。在我國該病主要引起雞胚死亡，孵化率降低，雛雞的急性死亡。1周齡內(nèi)的雛禽最易感，發(fā)病雛禽表現(xiàn)為氣喘、精神沉郁、飲食欲降低，多數(shù)因衰竭或繼發(fā)其他傳染病而導(dǎo)致生長緩慢或死亡。1月齡以上的雞有一定的抵抗力，成雞

2、感染后基本無異常表現(xiàn)，為健康帶菌，但其所產(chǎn)種蛋帶菌，可造成本病的垂直傳播。 近年來，細菌細胞膜中的一種重要組成成分外膜蛋白(outer-membrane-protein，OMP)的免疫作用越來越受到科技人員的關(guān)注，并進行了研究。實驗證明，OMP具有良好的免疫原性，不僅可刺激體液免疫，而且也可刺激細胞免疫作用。 基于病原菌的常規(guī)分離、鑒定方法費時費力，2～3d內(nèi)不能得出準(zhǔn)確結(jié)果。而單克隆抗體(monoclonal anti

3、body，McAb)具有特異性強、敏感性高、只識別單一抗原位點等特性，所以其在病原檢測、病原亞型鑒別等方面具有不可替代的優(yōu)點，在國內(nèi)外生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的研究和應(yīng)用。因此本試驗提取并純化了禽波氏桿菌的OMP，用制備并純化的禽波氏桿菌OMP免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾細胞和骨髓瘤細胞SP2/0融合，研制成功了禽波氏桿菌OMP單克隆抗體，這為禽波氏桿菌ELISA診斷試劑盒的研制和膠體金試紙條等快速檢測方法、抗原表位分析、細菌分型和臨床

4、治療等方面奠定了基礎(chǔ)。 本課題主要研究內(nèi)容包括以下三個方面： 試驗一、禽波氏桿菌OMP間接ELISA檢測方法的建立 本試驗采用改良的Wooldridge法提取了禽波氏桿菌P5株外膜蛋白(OMP)，通過Bradford方法測定禽波氏桿菌OMP含量為640μg/mL，SDS-PAGE電泳檢測禽波氏桿菌OMP含有5種成分，分子量分別為58、47、41、36、24KD；將提取的禽波氏桿菌OMP經(jīng)凝膠層析柱分離純化，得到分

5、子量為58KD的主蛋白帶。用純化的禽波氏桿菌OMP免疫Balb/c小鼠，每2周免疫1次，共計免疫4次，獲得了鼠抗禽波氏桿菌OMP的抗血清，以此抗血清建立了檢測禽波氏桿菌OMP的間接ELISA方法，試驗結(jié)果表明抗原、抗血清最佳工作濃度分別為10μg/mL、1：12800，酶標(biāo)二抗工作濃度為1：10000，用碳酸鹽緩沖液(0.05mol/L，pH9.6)作包被液；選擇含1％BSA的PBST作封閉液；最佳包被條件為4℃、24h包被；最佳封閉條

6、件為37℃、2h；血清反應(yīng)時間為60min；酶標(biāo)抗體反應(yīng)時間為60min；底物反應(yīng)時間為15min。本試驗為檢測小鼠免疫禽波氏桿菌OMP后體內(nèi)抗體效價和雜交瘤細胞篩選過程中培養(yǎng)上清中抗體水平的高低、以及制備的腹水抗體效價的高低、篩選分泌禽波氏桿菌OMP單克隆抗體雜交瘤細胞株奠定了基礎(chǔ)。 試驗二、禽波氏桿菌OMP雜交瘤細胞株的建立及單克隆抗體的制備 本試驗用純化的禽波氏桿菌OMP免疫6～8周齡的Balb/c小鼠，每2周免疫

7、一次，三免后用建立的間接ELISA法測定小鼠的血清效價，取血清效價較高的小鼠進行加強免疫。利用單克隆抗體技術(shù)，在加強免疫4天后，取Balb/c小鼠脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞，在50％PEG4000的作用下進行細胞融合，融合率達65％，用建立的間接ELISA方法進行篩選，陽性率為12％。取陽性值最高的細胞孔進行有限稀釋法克隆，經(jīng)4次克隆，獲得了3株穩(wěn)定分泌抗單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為3G10、4A3和4E8株，這三株雜交瘤細胞

8、株均能穩(wěn)定的分泌抗禽波氏桿菌OMP的單克隆抗體。 試驗三、禽波氏桿菌OMP單克隆抗體生物學(xué)特性研究本試驗對制備的禽波氏桿菌OMP單克隆抗體的生物學(xué)特性進行鑒定。經(jīng)間接ELISA法測定，雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液抗體的效價分別為1：320、1：640和1：640，腹水的效價分別為1：6400、1：12800和1：12800。其IgG亞類為2株IgG1和1株IgG3。經(jīng)Western-blot鑒定表明這3株單抗均具有良好的特異性。這3株雜