基于全基因組序列分析篩選羅非魚源無(wú)乳鏈球菌ZQ0910株保護(hù)性抗原及其免疫保護(hù)性研究.pdf

1、鏈球菌(Streptococcus)是一種能感染多種宿主（人類、畜禽及水生動(dòng)物等）并引起嚴(yán)重疾病的病原菌。近年來(lái)由無(wú)乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）引起的魚類鏈球菌病在我國(guó)南方羅非魚主養(yǎng)區(qū)頻頻爆發(fā)，給該產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，這迫使我們必須加強(qiáng)對(duì)無(wú)乳鏈球菌病害傳播的預(yù)防和控制。疫苗是預(yù)防和控制傳染性疾病的最有效手段之一，然而在羅非魚源無(wú)乳鏈球菌毒力因子和致病機(jī)理尚不清楚的前提下，該菌亞單位疫苗的研制也受到了

2、制約，迄今仍未開發(fā)出有效的漁用無(wú)乳鏈球菌亞單位疫苗并應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐中。
　　基于此，本研究采用多位點(diǎn)序列分型（Multilocus sequence typing，MLST）方法對(duì)2010-201年收集鑒定的104株羅非魚源無(wú)乳鏈球菌進(jìn)行基因水平的分型，確定不同地區(qū)分離的無(wú)乳鏈球菌（S.agalactiae）主要基因類型，并與國(guó)際上流行的菌株進(jìn)行比較，獲得了它們的遺傳背景和變異趨勢(shì)等信息；在分型結(jié)果的基礎(chǔ)上選取6株具有區(qū)域和分型代

3、表性的菌株在羅非魚魚體上進(jìn)行了致病性分析，篩選出具有良好免疫原性的菌株作為疫苗制備菌株。采用“鳥槍法”對(duì)篩選的無(wú)乳鏈球菌ZQ0910株進(jìn)行了全基因組測(cè)序，并開展了序列分析及基因注釋等工作；從2022個(gè)ORF中篩選了5個(gè)疫苗候選蛋白分子，利用基因工程技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了表達(dá)純化，同時(shí)進(jìn)行了羅非魚活體實(shí)驗(yàn)；此外，我們將sip基因作為抗原基因，成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-sip并在魚體上進(jìn)行了免疫保護(hù)性實(shí)驗(yàn)。
　　具體研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下

4、：
　　1、2010-2011年間，通過(guò)實(shí)地走訪調(diào)查，從我國(guó)南方三?。◤V東、廣西、海南）羅非魚主養(yǎng)區(qū)患病羅非魚體內(nèi)收集分離了104株羅非魚源無(wú)乳鏈球菌（S.agalactiae），并對(duì)這104株鏈球菌進(jìn)行了生理生化及分子生物學(xué)鑒定。
　　2、采用多位點(diǎn)序列分析（MLST）技術(shù)對(duì)上述104個(gè)無(wú)乳鏈球菌（S.agalactiae）分離株進(jìn)行分型。結(jié)果表明，104個(gè)分離株可分為3個(gè)不同的序列型（ST-7、NST-1及NST-2）。

5、其中，常規(guī)型ST-7共8株，新的基因型NST-192株，NST-24株；等位基因圖譜表明，兩個(gè)新的序列型與 ST-7型的親緣關(guān)系非常相近，屬同一個(gè)克隆復(fù)合物。
　　3、南方地區(qū)羅非魚源無(wú)乳鏈球菌（S.agalactiae）6個(gè)不同分離菌株的致病性分析結(jié)果表明，廣東肇慶分離株ZQ0910相對(duì)于其他菌株對(duì)羅非魚具有較強(qiáng)的致病力，這也說(shuō)明該菌株具較好的免疫原性，可有效刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
　　4、采用“鳥槍法”測(cè)序策略對(duì)羅非魚源

6、無(wú)乳鏈球菌 ZQ0910株進(jìn)行了全基因組測(cè)序，并進(jìn)行了序列分析及基因注釋。相關(guān)數(shù)據(jù)提交至DDBJ/EMBL/GenBank數(shù)據(jù)庫(kù),基因登陸號(hào)為AKAP00000000。
　　5、以無(wú)乳鏈球菌（S.agalactiae）ZQ0910全基因組序列為基礎(chǔ)，應(yīng)用生物信息學(xué)軟件和公用生物網(wǎng)站上的工具，對(duì)無(wú)乳鏈球菌（S.agalactiae）ZQ0910株全基因組編碼的2022個(gè)ORFs逐個(gè)進(jìn)行了比對(duì)搜索，獲得了21個(gè)與致病性或免疫原性相關(guān)的

7、蛋白。經(jīng)文獻(xiàn)查閱和篩選，最終確定5個(gè)蛋白分子作為后續(xù)保護(hù)性抗原研究的靶蛋白，分別為：SIP、Hemolysin、FBP、VaA、HtrA。
　　6、將上述5個(gè)候選蛋白基因分別克隆到原核表達(dá)載體pET28a(+)和pET32a(+)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta中，獲得了5個(gè)表達(dá)候選分子的重組工程菌（pET32-Sip、pET28-Hemolysin，pET28-Fbp，pET28-VaA，pET28-HtrA）。采用 Ni-NTA

8、親和層析純化了5個(gè)重組工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。
　　7、將以上5個(gè)純化蛋白分別免疫吉富羅非魚（Oreochromis niloticus）以檢測(cè)其對(duì)魚體的免疫應(yīng)答能力。研究結(jié)果表明，5個(gè)疫苗候選蛋白分子均能提供有效的保護(hù)力，其中以SIP組效果最好，免疫保護(hù)率達(dá)到80％。此外，HtrA組、FBP組、Hemolysin組和VaA組的免疫保護(hù)率分別為75%、74%、70%和70%。
　　8、將Sip基因克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3

9、.1(+)構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA-Sip，并以肌肉注射方式免疫吉富羅非魚（O.niloticus）。分別于免疫后第7和28d取樣，采用PCR及RT-PCR方法檢測(cè)pcDNA-Sip在各個(gè)組織（包括肌肉、脾臟、頭腎、鰓及肝臟）中的表達(dá)情況；分別于免疫后第7、14、21及28 d采集血清，使用ELISA方法檢測(cè)抗體效價(jià)；同時(shí)，免疫28d后進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)以計(jì)算疫苗的免疫保護(hù)率。研究結(jié)果表明，在肌肉、脾臟、頭腎、鰓及肝臟組織中均能檢測(cè)到pcDNA