家蠶Mod(mdg4)基因的表達(dá)分析及亞細(xì)胞定位.pdf

1、從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的家蠶蛹cDNA文庫(kù)中獲得一條編碼(Th.modifie.ofmdg4)Mod(mdg4)蛋白的cDNA序列，命名為BmMOD。該序列在GenBank的登錄號(hào)為：DN237077，其ORF為108.bp，編碼359個(gè)氨基酸。對(duì)該推測(cè)的序列進(jìn)行同源性(blastp)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該蛋白具有兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域：位于N端的BTB保守結(jié)構(gòu)域和位于C端的FLYWCH保守結(jié)構(gòu)域。與黑腹果蠅、赤擬谷盜、岡比亞按蚊以及埃及伊蚊的氨基酸同源性只有

2、不到40％。通過(guò)SignalP3.0分析發(fā)現(xiàn)該蛋白N末端不存在信號(hào)肽。
　　 利用PCR擴(kuò)增目的基因完整的ORF，經(jīng)過(guò)BamHI和HindIII雙酶切，將該基因克隆到載體pET-28a(+)中，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a(+)-BmMOD。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21并誘導(dǎo)表達(dá)，超聲破碎之后經(jīng)過(guò)SDS-PAGE鑒定發(fā)現(xiàn)此融合蛋白以包涵體形式存在。處理包涵體獲得含有目的蛋白的溶液，通過(guò)N.Sepharos.6Fas.Flow親合層析

3、柱純化融合目的蛋白His-BmMOD，再通過(guò)反相快速液相色譜(RP-FPLC)進(jìn)一步純化，質(zhì)譜鑒定該蛋白的分子量為42.6kDa，與理論值相符。將純化的融合蛋白作為抗原免疫新西蘭兔制備多克隆抗血清，ELISA檢測(cè)效價(jià)達(dá)到1:6400以上。為了進(jìn)一步檢測(cè)該蛋白在家蠶不同時(shí)期以及組織中的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)情況，分別提取了家蠶不同時(shí)期及組織的總RNA與總蛋白。RT-PCR檢測(cè)家蠶卵、五齡幼蟲(chóng)、蛹、蛾等發(fā)育時(shí)期，以及五齡幼蟲(chóng)各組織中的靶mRNA的量，從