捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)絲氨酸蛋白酶抑制因子基因的克隆、表達(dá)與生物學(xué)特性研究.pdf

1、羊是我國(guó)重要的家畜品種，全國(guó)各地分布廣泛，飼養(yǎng)量居世界第一，由于管理粗放，寄生蟲(chóng)發(fā)病率和患病數(shù)量巨大，據(jù)調(diào)查，我國(guó)山、綿羊嬴患捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)病的比例高達(dá)50％-93.85%，給養(yǎng)殖業(yè)主造成了巨大的損失，嚴(yán)重影響了養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展．捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)屬毛圓科(Traehostrongylidae)血矛屬(Haemonchus)線蟲(chóng)，寄生于羊的真胃和小腸前段，引起貧血綜合癥，造成感染羊貧血，消瘦和衰弱，甚至死亡．
　　 絲氨酸蛋白酶抑制因子是天

2、然免疫系統(tǒng)的組成成分之一，屬于絲氨酸蛋白酶抑制因子超家族蛋白成員，該家族蛋白參與的反應(yīng)涉及血液凝固、抑制蛋白酶活性、炎性細(xì)胞趨化分泌、黑化、生殖、細(xì)胞凋亡．腫瘤轉(zhuǎn)移和信號(hào)傳導(dǎo)等重要的生理過(guò)程．絲氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶抑制因子在寄生蟲(chóng)感染和免疫應(yīng)答中具有重要作用，它們彼此協(xié)同直接導(dǎo)致病源入侵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和級(jí)聯(lián)放大，調(diào)節(jié)體內(nèi)的生化反應(yīng)和代謝強(qiáng)度，如血液凝固、蛋白水解和信號(hào)傳導(dǎo)等，因此，克隆捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的絲氨酸蛋白酶抑制因子基因并研究其功能，

3、將有助于進(jìn)一步研究捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的入侵機(jī)制和羊抗捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的免疫防御機(jī)制，豐富和發(fā)展抗寄生蟲(chóng)免疫學(xué)的內(nèi)容．
　　 本研究采用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)，首次克隆了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)絲氨酸蛋白酶抑制因子基因（hcserpin），并對(duì)此基因進(jìn)行了測(cè)序分析和原核表達(dá)，利用親和色譜和排阻色譜技術(shù)，獲得了純化重組蛋白HCSERPIN，在此基礎(chǔ)上對(duì)HCSERPIN的生物學(xué)特性做了如下研究：
　　 1.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)serpin基因的克隆與序列

4、分析
　　 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)絲氨酸蛋白酶抑制因子屬于絲氨酸蛋白酶的抑制因子超家族蛋白，這類(lèi)抑制因子引發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)廣泛參與寄生蟲(chóng)和宿主問(wèn)的病理生理過(guò)程．為了克隆捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)絲氨酸2白酶抑制因子基因，本文根據(jù)GenBank發(fā)表的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)成蟲(chóng)絲氨酸蛋白酶抑制因子基因的EST序列(GenBank登錄號(hào)為：BM173953，長(zhǎng)度536bp)．設(shè)計(jì)并合成特異性引物，分別采用3’-和5’-cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（RapidAmplifica

5、tion of cDNA Ends，RACE），獲得了該基因的3’-和5’-末端序列．通過(guò)序列拼接，得到捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)serpin全基因序列，并將該serpin基因序列遞交GenBank確認(rèn)（確認(rèn)登錄號(hào)：FJ888352）．序列分析與比對(duì)表明，該基因全長(zhǎng)為1317 bp，其5'-末端-2-22處有一21bp的SL1剪接導(dǎo)引序列．由SL1序列是捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)操縱子結(jié)構(gòu)下游基因的標(biāo)志分析，標(biāo)志著下游serpin基因的存在，表明serpin在基因

6、組中以操縱子結(jié)構(gòu)形式存在，且屬于該操縱子下游基因．SL1后間隔一個(gè)稿基推測(cè)的最大開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)為ll04 bp，編碼一條367個(gè)氨基酸組成的多肽鏈，該基因與已知serpin核酸序列同源性分別為66--100%．對(duì)該序列進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，由serpin基因所推測(cè)蛋白的367個(gè)氨基酸殘基有4個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，11個(gè)0-糖基化位點(diǎn)，3個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，2個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)，4個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)，3個(gè)肉豆蔻酯?；稽c(diǎn)，推測(cè)其為糖

7、蛋白，其理論等電點(diǎn)和最大分子量(Theoretical pI/Mw)分別為8.5/41016.17道爾頓．Serpin標(biāo)志序列FEANHPFLFIL位于推測(cè)蛋白的344-354氨基酸處，并無(wú)信號(hào)肽剪切位點(diǎn)．該蛋白與已知Serpins的氨基酸同源性為31--53%．C-端結(jié)構(gòu)域的同源性為29-62%不等．C-端的保守性Serpins超家族基序分別位于RSLI:GTTA319-322，RSL2: FEANHP344-349．根據(jù)以上的比較與

8、分析，本研究采用RACE克隆的全長(zhǎng)cDNA是屬于serpin蛋白家族的新基因．
　　 2．HCSERPIN的原核表達(dá)與重組蛋白純化
　　 根據(jù)獲得的hcserpin基因全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，采用RT-PCR方法，擴(kuò)增該全長(zhǎng)cDNA序列的最大閱讀框，連接于PMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序，選擇測(cè)序正確的質(zhì)粒切取目的基因片段，定向克隆于pET32a(+)質(zhì)粒載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET3

9、2a(+)-hcserpin．導(dǎo)入大腸桿菌BL21( DE3)表達(dá)，用IPTG誘導(dǎo)，獲得重組蛋白HCSERPIN，經(jīng)親和色譜和排阻層析分離與純化，獲得純化的rHCSERPIN蛋白；以此rHCSERPIN免疫大鼠，制備多克隆抗體，用Western blotting檢測(cè)rHCSERPIN免疫原性，以免疫血清檢測(cè)蟲(chóng)體可溶性蛋白和自然感染Hcontortus山羊血液內(nèi)的HCSERPIN抗體．結(jié)果重組質(zhì)粒經(jīng)酶切與PCR鑒定，亞克隆的ORF序列與預(yù)

10、期的完全一致，定向連接正確，IPTG誘導(dǎo)后，表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在，經(jīng)過(guò)兩次色譜純化、復(fù)性的重組蛋白rHCSERPIN，分量大小約為60.5kD與預(yù)期相符，電泳檢測(cè)為單一條帶．ELISA檢測(cè)表明，rHCSERPIN蛋白具有良好的免疫原性，蟲(chóng)體可溶性蛋白檢測(cè)可見(jiàn)一條HCSERPIN蛋白帶，表明蟲(chóng)體內(nèi)的HCSERPIN無(wú)異構(gòu)體或聚合體分子存在．同時(shí)發(fā)現(xiàn)自然感染的山羊血清中存在抗rHCSERPIN蛋白的抗體，說(shuō)明蟲(chóng)體的HCSERPIN蛋白能

11、夠泌出Hcontortus細(xì)胞外進(jìn)入山羊組織，引起山羊抗H.contortus的免疫應(yīng)答．通過(guò)蛋白質(zhì)rHCSERPIN的表達(dá)純化，為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)絲氨酸蛋白酶抑制因子的性質(zhì)、功能和在蟲(chóng)體中的分布等各項(xiàng)研究，奠定了基礎(chǔ)．
　　 3.rHCSERPlN抗胰蛋白酶作用及最適反應(yīng)條件
　　 將復(fù)性的重組HCSERPIN蛋白用PBS緩沖液調(diào)整到一定的濃度，與一定量的牛trypsin均勻混合，置于37℃水浴孵育，再加入一定量溶于同樣緩

12、沖液的牛血清白蛋白作底物，繼續(xù)孵育一段時(shí)間，反應(yīng)結(jié)束通過(guò)12%SDS-PAGE變性凝膠電泳法，測(cè)定trypsin對(duì)底物水解能力的變化．另以BAEE為底物測(cè)定trypsin的酶活性抑制率，以及rHCSERPIN抑制活性的最適pH和最適溫度．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，rHCSERPIN能顯著抑制反應(yīng)管中trypsin活性，抑制率最高達(dá)52.3%，抑制后可見(jiàn)SDS-PAGE膠中牛血清白蛋白水解不完全，對(duì)照管中的BSA水解完全．rHCSERPIN產(chǎn)生抑制作

13、用的最適pH為7.6，最適反應(yīng)溫度介于37℃--75℃之間．說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)表達(dá)純化的rHCSERPIN對(duì)trypsin有抑制作用，屬于耐熱型酶，最適抑制pH為7.6．這些結(jié)果將為進(jìn)一步闡明H.contortus生化特性、致病機(jī)理及免疫機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)．
　　 4．rHCSERPIN的體外抗凝血試驗(yàn)
　　 通過(guò)采用試管法測(cè)定純化rHCSERPIN的體外凝血時(shí)間，將rHCSERPIN調(diào)整為5ug/ul，0.5 ug/ul和0.0

14、5 ug/ul，測(cè)定體外抗凝血酶時(shí)間和血漿復(fù)鈣時(shí)間，研究大腸桿菌表達(dá)純化后的重組HCSERPIN對(duì)凝血系統(tǒng)的作用，所有數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)Excel2008統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析．結(jié)果表明，rHCSERPIN能顯著延長(zhǎng)兔全血的凝固時(shí)間，濃度50 ug/lOOul的rHCSERPIN能將兔全血的凝血時(shí)間延長(zhǎng)一倍．在給定的劑量實(shí)驗(yàn)中，rHCSERPIN能延長(zhǎng)抗凝血酶時(shí)間和復(fù)鈣時(shí)間(p<0.01)，隨著蛋白濃度的增加，這種凝固時(shí)間也相應(yīng)延長(zhǎng)，呈現(xiàn)出明顯的劑量依

15、賴(lài)關(guān)系．這些結(jié)果說(shuō)明，rHCSERPIN對(duì)內(nèi)源性激活的凝血途徑以及外源性凝血過(guò)程，均有抑制作用．
　　 5．HCSERPIN在H.contortus體內(nèi)的分布
　　 新鮮采集的Hcontortus成蟲(chóng)經(jīng)波恩氏液固定，石蠟包埋切片，采用免疫組化的方法研究HCSERPIN蛋白在雌、雄Hcontortus成蟲(chóng)體內(nèi)的分布與表達(dá)．結(jié)果表明，特異性免疫反應(yīng)僅出現(xiàn)在H.contortus消化道黏膜上皮細(xì)胞，進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，這種特異性免