血小板抗原抗體檢測及其臨床應(yīng)用檢驗科-

1、血小板抗原抗體檢測及臨床應(yīng)用,長春博德生物技術(shù)有限責(zé)任公司郭超,,,目 錄 / contents,血小板抗原,血小板抗體與疾病,血小板抗體檢測的意義和臨床應(yīng)用,血小板簡介,血小板：D:2-5um V:紅細(xì)胞*1/5功能：促進止血和加速凝血正常范圍：100-300×109/L,骨髓干細(xì)胞,,,,,,胞質(zhì)塊脫落,來源：,多功能祖細(xì)胞,巨核祖細(xì)胞,幼巨核細(xì)胞,巨核細(xì)胞,血小板,血小板形態(tài),靜息狀態(tài),活化狀態(tài),

2、,,血小板抗原,血小板“非特異性”抗原,血小板“特異性”抗原 HPA抗原,HLA-Ⅰ類抗原 ABH抗原,主要存在于血小板膜的GP分子上，也少量存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞、結(jié)締組織細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。1990年國際輸血協(xié)會血小板免疫學(xué)工作組提出了HPA命名，以發(fā)現(xiàn)的時間順序排列：HPA-1、HPA-2、HPA-3等系統(tǒng)。,HPA抗原,已確定了33個HPA，其中12 個抗原為雙等位基因表達(dá)（HPA-1,-2,-3,-4，-5和

3、-15）。其中高頻率抗原命名a，低頻率抗原命名b。其余21個抗原為低頻率抗原，尚未發(fā)現(xiàn)對偶抗原，命名為bw。單核苷酸多態(tài)性（SNP）:33個HPA中均已搞清楚基因背景，其中32個HPA的多態(tài)性型是由一個氨基酸置換所致，而這又是由編碼血小板膜糖蛋白（GP）基因的一個核苷酸的不同所致。HPA-14bw不具有單核苷酸多態(tài)性。其核苷酸置換發(fā)生在 AAG1929-31。,HPA抗原,,HPA抗原,HPA抗原,血小板抗原定型,血清學(xué)定型即

4、用已知特異性抗體檢測血小板血型抗原缺點：特異性抗體來源困難 ---人血清中血小板抗體通常為多特異性 ---單克隆抗體匱乏，目前國際上僅有HPA-1a單抗， 無其它HPA單抗?；蚨ㄐ拖拗菩云伍L度多態(tài)性分析（RFLP）序列特異性寡核苷酸聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-SSO)序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-SSP),用途：（1）健康人群HPA基因分型，建立已知HPA基因型

5、的血小板獻(xiàn)血員庫。（2）檢測受者HPA基因型，以便從血小板獻(xiàn)血員庫中尋找與其HPA基因型相 匹配的血小板供者。（3）檢測患者HPA基因型，輔助臨床胎兒/新生兒免疫性血小板減少癥、輸 血后紫癜及血小板輸注無效癥等疾病的病因診斷。（4）對特定區(qū)域或種族人群HPA基因分型，可為人類遺傳學(xué)研究提供相關(guān) 資料和證據(jù)。,血小板抗原定型,血小板抗體的產(chǎn)生方式,以上途徑產(chǎn)生的血小板同種抗體與血小板上的相應(yīng)抗原結(jié)合，導(dǎo)

6、致血小板被內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)清除。,移植（骨髓、器官）,輸血小板、紅細(xì)胞（尤其是沒有濾白的紅細(xì)胞）,血小板抗體與部分相關(guān)疾病,,,胎盤屏障,,,母體同種異體免疫,胎兒血小板減少,舉例——NAIT,NAIT,胎母同種異體免疫血小板減少癥（fetomaternal alloimmune thrombocytopenia，F(xiàn)MAIT）致病機理與新生兒溶血?。℉DN）相似，前者是由胎兒父母血小板抗原不合引起的血小板減少癥，后者為紅細(xì)胞抗原不合引起的溶

7、血性疾病。由于胎兒遺傳自父親的血小板抗原刺激母體產(chǎn)生IgG型的抗血小板抗體，該抗體能通過胎盤進入胎兒體內(nèi)并與具有相應(yīng)抗原的血小板結(jié)合，此致敏血小板在胎兒的血液循環(huán)中被清除而使得胎兒血小板減少，出現(xiàn)瘀點和瘀斑，其嚴(yán)重者會導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損傷（占已報道病例的20%）、10%出現(xiàn)顱內(nèi)出血(死亡率近100%）。因多數(shù)病例在出生后才得以診斷，故此病也稱作新生兒同種異體免疫血小板減少癥。初次妊娠婦女即可發(fā)生FMAIT，其發(fā)病率大約為1/800-1

8、500 。,FMAIT患兒病情變化較大，具有自限性，常在出生后 2-3周恢復(fù)。輕度血小板減少患兒有時沒有任何臨床癥狀。病情較重患兒 臨床表現(xiàn)為皮膚、體內(nèi)外黏膜出血，出現(xiàn)紫癜、瘀點或瘀斑。嚴(yán)重患兒可能發(fā)生顱內(nèi)出血（intracranial haemorrhage， ICH），占10%。與FMAIT相關(guān)的ICH 80%發(fā)生在子宮內(nèi)，其中14%發(fā)生在妊娠20 周前，28%發(fā)生在妊娠30周前。,NAIT臨床表現(xiàn),

9、母體血清抗HPA抗體檢測，然而母體抗體水平到預(yù)產(chǎn)期時逐漸下降，約有30%的病例抗體陰性。父母雙親的HPA基因檢測，在高加索地區(qū)采取對其HPA-1和HPA-5基因檢測，而在亞洲地區(qū)應(yīng)考慮進行HPA-4和HPA-5基因檢測。父母雙親交叉配型實驗，將母體血清與父親血小板進行交叉配型實驗，即使不能確切知道不相合的抗原，但這種方法也能發(fā)現(xiàn)母體是否存在血小板同種異體免疫反應(yīng)。,NAIT早期診斷與篩查,NAIT,NAIT,,血小板抗體檢測常用

10、方法,方法,指標(biāo),,血小板抗體檢測方法-固相凝集法,血小板抗體篩檢，包括HLA抗體、HPA抗體及其它血小板反應(yīng)性抗體。輔助血小板相關(guān)免疫性疾病的診斷?；颊咦陨砜贵w檢測，包括血小板結(jié)合抗體和血清中游離抗體。檢測血小板結(jié)合抗體可將患者血小板平鋪在反應(yīng)孔后，直接加入抗人IgG和指示紅細(xì)胞進行檢測。血清中的游離抗體可通過患者自身血小板和血清反應(yīng)來檢測。,用途：,血小板抗體檢測方法-固相凝集法,1.主要應(yīng)用科室：檢驗科，血液病科，婦產(chǎn)科，新生

11、兒科。 2.檢驗科： 檢驗科在常規(guī)血型鑒定中加入血小板抗體檢測，可對臨床輸血中出現(xiàn)發(fā)熱、黃疸、急性肺損傷等非溶血性輸血反應(yīng)的風(fēng)險作出評估。,血小板抗體檢測臨床意義,3.婦產(chǎn)科:孕前，孕期，產(chǎn)后1).反復(fù)流產(chǎn)、不孕不育查因：對于反復(fù)和習(xí)慣性流產(chǎn)史（尤其是孕早期）和不孕不育史的患者，檢測患者血清和血漿中血小板抗體的水平，可對其造成流產(chǎn)和不孕不育的原因作出輔助診斷。2).產(chǎn)檢（尤其針對高齡和二胎產(chǎn)婦）孕早期檢測：在孕早期（

12、三個月）產(chǎn)檢中常規(guī)檢測母親與胎兒的血小板相容性，對于孕早期出現(xiàn)流產(chǎn)和死胎的風(fēng)險評價具有非常重要的意義孕晚期檢測：在孕晚期（胎兒出生前）檢測母體血清或血漿中血小板抗體水平，對胎兒出生后罹患新生兒血小板同種免疫性疾病風(fēng)險評價具有非常重要的意義。3).妊娠期血小板降低的查因：孕婦在妊娠期血小板減少是一種常見現(xiàn)象，如是生理性降低則危害不大，往往生產(chǎn)后會恢復(fù)正常。但如果血小板的降低是由于孕婦自身免疫性疾病引起的則會引起流產(chǎn)、死胎、以及新生兒相

13、關(guān)的血小板減少性疾病，危害嚴(yán)重。,血小板抗體檢測臨床意義,,4.血液病科：1）自身免疫性疾病的輔助診斷：檢測患者血清和血漿中自身血小板抗體的水平和特異性，可輔助診斷自身免疫性疾病如白血病、再生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合癥、血小板減少癥、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、特發(fā)性血小板減少性紫癜等。 2）藥物性抗體的檢測：某些藥物的存在如肝素、奎寧、奎尼丁、環(huán)磷酞胺、甲氨蝶呤、阿司匹林、水楊酸鈉等，選擇性的抑制了骨髓巨核細(xì)胞造血功能，使血小板的生

14、成減少，同時應(yīng)用某種藥物后，產(chǎn)生藥物相關(guān)抗體，藥物抗體復(fù)合物附著血小板膜上與補體結(jié)合，使血小板聚集破壞，一些藥物進入人體后也可直接破壞血小板，造成血小板破壞增多，從而引發(fā)血小板減少。5.新生兒科：新生兒血小板同種免疫性疾病的輔助診斷。,血小板抗體檢測臨床意義,婦產(chǎn)科領(lǐng)域 檢驗科常規(guī)血型鑒定檢測（門診血型）自身免疫性疾病的輔助診斷藥物性抗體檢測,血小板抗體檢測臨床應(yīng)用,曾有反復(fù)流產(chǎn)史的育齡婦女，可在懷孕前進行夫妻雙方的血小

15、板相關(guān)抗體檢測，對由于母嬰血小板血型不合而導(dǎo)致的流產(chǎn)或 NAIT進行早期的診斷和治療。,青年女性流產(chǎn)率逐年上升,每一次懷孕、流產(chǎn)都可能造成母體因外來抗原刺激而產(chǎn)生抗體，危及下一次妊娠。,如何在孕前/孕期正確地評估因父母血小板血型不合引起的流產(chǎn)、NAIT的風(fēng)險？,血小板抗體檢測在婦產(chǎn)科領(lǐng)域的應(yīng)用,血小板抗體檢測在婦產(chǎn)科領(lǐng)域的應(yīng)用,父母血小板血型不合引起新生兒同種免疫性血小板減少癥的初步研究 鄧晶、夏文杰、葉欣、徐秀章、邵媛、陳揚凱

16、、丁浩強、羅廣平、王嘉勵（廣州血液中心臨床輸血研究所）熱帶醫(yī)學(xué)雜志 2012年11月第12卷第11期文中觀點： 通過收集22例臨床上確診為新生兒免疫性血小板減少癥（NIT）的患兒為研究對象，采用 ELISA 方法檢測患兒及其父母的血小板相關(guān)抗體，應(yīng)用 PCR-SSP法對患兒及父母進行 HLA及HPA基因分型，根據(jù)相應(yīng)的抗原進行抗體特異性分析。結(jié)果22例NIT患兒中，14 例是由于同種免疫性因素引起的，其中 27.3％（6例)由

17、HLA抗體引起,13.6％（3例）由HPA抗體引起，22.7％（5例）由HLA＋HPA 抗體引起 ；9.1％（2例）由于被動免疫性因素引起;27.3％（6例 ）由自身抗體引起 。其中,同種免疫性抗體以抗 HLA-A2、19，抗-B40 及抗 HPA-3a多見。結(jié)論： 在新生兒免疫性血小板減少癥中，主要以父母血小板血型不合引起新生兒同種免疫性血小板減少癥為主，臨床產(chǎn)前診斷預(yù)防和產(chǎn)后治療具有重要意義。,血小板抗體檢測在婦產(chǎn)科領(lǐng)域的應(yīng)用,血

18、小板抗體檢測在婦產(chǎn)科領(lǐng)域的應(yīng)用,檢測方案（僅供參考）,目前臨床對不良孕產(chǎn)史查因、不孕不育查因、反復(fù)和習(xí)慣性流產(chǎn)查因多采用綜合檢測方案排因如遺傳因素、感染因素、免疫性因素等。血小板抗體檢測可歸類在免疫性因素套餐中。如深圳某三甲醫(yī)院的免疫類檢測套餐項目包括抗甲狀腺微?？贵w（TMab）抗甲狀腺球蛋白抗體（TGab）抗核抗體滴度檢測狼瘡抗凝物質(zhì)檢測血漿D-二聚體檢測（D-Dimer）抗β2糖蛋白I型抗體抗精子抗體抗磷脂抗體血

19、小板特異性和組織相關(guān)融性抗體檢測（HPA+HLA I類）,檢測時段方案（僅供參考）,結(jié)果解釋,治療方案（僅供參考）,由血小板抗體陽性引起的相關(guān)性疾病可結(jié)合患者的個人情況建議采取茵陳湯調(diào)理并可適時服用阿司匹林（孕晚期禁用），丙球配合激素的治療方案（1）血小板抗體弱陽：可服用茵陳湯或阿司匹林調(diào)理。 （2）血小板抗體陽性：起始劑量為潑尼松10-20 mg/d，起效后逐漸減至維持量5-10mg。 （3）首次診斷者出現(xiàn)明顯血小板減少及出血

20、傾向：起始劑量為潑尼松 0.5-1 mg/（kg·d），血小板計數(shù)維持（20-30×10 9 /L以上且出血傾向改善后 2 周可逐漸減量。 （4）血小板抗體強陽性：期待快速起效時，可考慮大劑量的丙球0.4 g/（kg.d）持續(xù)3-5d，或甲基潑尼松龍1g/d持續(xù)3d。 （5）糖皮質(zhì)激素和丙球可同時使用。,,血小板抗體檢測應(yīng)用：非溶血性輸血反應(yīng)的風(fēng)險評估,白細(xì)胞特異性和組織相容性（HLA）抗體是引起臨床非溶血性發(fā)熱

21、性輸血不良反應(yīng)的最主要原因，尤其是有輸血史、輸血小板史、妊娠史、器官移植史、自身免疫性疾病史等的患者的臨床輸血工作中，非溶血性發(fā)熱反應(yīng)是臨床最常見的輸血不良反應(yīng)（約70%），文獻(xiàn)報道輸注紅細(xì)胞為2～6%，輸注血小板為20～30%，多次輸血患者高達(dá) 27％～63％，而非溶血性發(fā)熱性輸血反應(yīng)與白細(xì)胞特異性和組織相容性（HLA）抗體密切相關(guān)，是影響臨床安全輸血的嚴(yán)重因素。白細(xì)胞特異性和組織相容性（HLA）抗體的檢測對于預(yù)防和減少非溶血性發(fā)熱性

22、輸血反應(yīng)非常有意義。,血小板抗體檢測應(yīng)用：非溶血性輸血反應(yīng)的風(fēng)險評估,吳宇辰，徐笑紅，葉宏宇. 血小板抗體對非溶血性輸血反應(yīng)的影響. 中國輸血雜志，2015年第28卷第8期.,輸血反應(yīng)與血小板抗體的關(guān)系,血小板抗體檢測應(yīng)用：非溶血性輸血反應(yīng)的風(fēng)險評估,分兩個步驟：1、高危高發(fā)人群必檢2、可進入相關(guān)檢測套餐,血小板抗體檢測應(yīng)用：非溶血性輸血反應(yīng)的風(fēng)險評估,檢測建議：常規(guī)普檢已成為趨勢—浙江、貴州為代表的全國近50家醫(yī)院,血小板抗體檢

23、測應(yīng)用：非溶血性輸血反應(yīng)的風(fēng)險評估,檢測套餐參考：,血小板抗體檢測應(yīng)用：非溶血性輸血反應(yīng)的風(fēng)險評估,檢測套餐參考：1、常規(guī)血型鑒定套餐2、術(shù)前配血套餐3、與紅細(xì)胞血型抗體篩查檢測捆綁,1、能不輸血就不輸血2、輸濾白、輻照血3、輸自體血4、血漿置換5、臨床干預(yù)（免疫抑制、丙球、激素、中醫(yī)中藥調(diào)理）并告知輸血風(fēng)險,血小板抗體檢測應(yīng)用：非溶血性輸血反應(yīng)的風(fēng)險評估,臨床處理方案參考：,,進行血小板抗體檢測，可以輔助診斷血小板免疫性

24、疾病，如ITP。,自身免疫性疾病的輔助診斷,一般認(rèn)為，ITP的發(fā)病機制包括血小板自身抗體導(dǎo)致的血小板破壞和清除。,檢測患者血小板自身結(jié)合抗體，了解血小板是否在體內(nèi)致敏，是血小板自身抗體導(dǎo)致ITP發(fā)生的直接證據(jù),檢測患者血小板自身游離抗體，了解血漿中的自身抗體是否能在體外與患者自身血小板結(jié)合，是血小板自身抗體導(dǎo)致ITP發(fā)生的間接證據(jù),自身免疫性疾病的輔助診斷,血液病患者血小板抗體檢測及其與血小板輸注療效的相關(guān)性研究夏世勤 蘇莉 劉

25、秋洪 楊眉 安邦權(quán) 王茂玲 于慧芳1．貴州省人民醫(yī)院輸血科 ，2．遵義醫(yī)學(xué)院檢驗系，結(jié)論 ① 血小板抗體的產(chǎn)生與血小板輸注療效密切相關(guān)，血小板抗體是直接影響血小板輸注效果 的重要免疫因素之一 ；②血液病患者的病因與血小板抗體的產(chǎn)生有一定相關(guān)性 ；③ 血小板抗體的產(chǎn)生與患者性別無關(guān) ；④ 血小板輸注次數(shù)與血小板抗體產(chǎn)生密切相關(guān)：⑤ 血小板抗體的產(chǎn)生與輸注的血小板種類有關(guān)，單采組明顯低于濃縮組。

26、 醫(yī)學(xué)檢驗 · 2013年8月第2O卷第22期,流式細(xì)胞技術(shù)檢測血小板相關(guān)抗體在ITP診斷中的應(yīng)用研究吳國才，王珍(廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 血液內(nèi)科 ，廣東 湛江 524001)摘要 ：目的 探討流式細(xì)胞技術(shù)檢測血小板相關(guān)抗體在ITP診斷中的意義 。方法 選擇2012年5月至2013年6月在我院血液科住院的3O例ITP患者為觀察組,

27、同期本院健康體檢正常者3O例為對照組，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測兩組對象的外周血血小板相關(guān)抗體PAIg(PAIgG 、PAIgM 、PAIgA )水平 。結(jié)果FCM檢測觀察組患者血小板抗體 ，PAIgG陽性率為7O,平均熒光強度為(25.154-2.61)，對照組平均熒光強度為 (5.09士0.54),兩組比較有顯著性差異(P 0.05)。結(jié)論 流式細(xì)胞儀檢測血小板相關(guān)抗體 在ITP診斷中具有重要的臨床意義

28、 中國實驗診斷學(xué) 2O14年6月第18卷第 6 期,自身免疫性疾病的輔助診斷,許多藥物會導(dǎo)致血小板減少，常見的有肝素、奎寧、奎尼丁等，均會誘導(dǎo)產(chǎn)生藥物依賴性血小板抗體，從而產(chǎn)生血小板減少癥。 藥物性抗體產(chǎn)生的機制尚不完全明了。目前認(rèn)識的產(chǎn)生機制主要有： 免疫復(fù)合物機制：藥物與抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物，與血 小板上的F

29、c受體結(jié)合，介導(dǎo)血小板的破壞。 半抗原機制：藥物小分子與血小板膜蛋白結(jié)合，形成新的 抗原，刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體，從而破壞血小板。,藥物性抗體檢測,可能產(chǎn)生藥物性抗體的用藥：抗生素類：頭孢他啶、頭孢曲松、磺胺類、萬古霉素鎮(zhèn)痛劑：芬太尼、布洛芬、對乙酰氨基酚消化系統(tǒng)用藥：雷尼替丁、心血管系統(tǒng)用藥：ACEI、β阻滯劑抗腫瘤藥：奧沙利鉑,2. MF Leach. Detection of drug-de

30、pendent platelet antibodies by use of solid-phase red cell adherence assay. British Journal of haematology,1997,97,755-761.,1. Alan D. Michelson Platelets, Third Edition，Chapter 42,藥物性抗體檢測,懷疑患者因應(yīng)用藥物而導(dǎo)致血小板減少癥時，應(yīng)準(zhǔn)備相應(yīng)的藥物。

31、如果為液體劑型，可以直接使用。如果為固體劑型，需要將其破碎、溶解于蒸餾水中。 對于免疫復(fù)合物機制，可以將藥物直接加入待檢標(biāo)本中；對于半抗原機制，可將其加入0.5%緩沖液中。 檢測時加入藥物的濃度，應(yīng)參照相應(yīng)藥物的藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)，選用下列三個濃度： 1.略低于谷濃度 2.峰濃度 3.峰濃度的5-10倍。,藥物性抗體檢測,對照標(biāo)

32、本與血小板,無藥物性血小板減少癥的健康人標(biāo)本，作為本實驗的對照標(biāo)本。,4-6人份混合，O型血小板。該血小板與待檢血小板做配型實驗，結(jié)果應(yīng)為陰性。,藥物性抗體檢測,,,,每一個標(biāo)本使用三條試劑，一條用于免疫復(fù)合物機制，兩條用于半抗原機制。,PC,NC,免疫復(fù)合物機制,半抗原機制,,,對 照 標(biāo) 本,,,,,,,,陽 性 對 照,陰 性 對 照,檢 測 標(biāo) 本,藥物性抗體檢測,操作步驟：免疫復(fù)合物機制,1. 將血小板包被在微孔板上，洗板3次

33、2. 加入兩滴低離子強度溶液3. 加入兩滴已加入不同濃度藥物的待檢標(biāo)本（同時加入不添 加藥物的待檢標(biāo)本作為對照）4. 向陽性對照、陰性對照對照孔中分別加入試劑盒中的陽性 對照、陰性對照5. 37℃氣育45分鐘6. 洗板5次7. 立即加入抗人IgG及指示紅細(xì)胞，混勻8. 離心，觀察結(jié)果,藥物性抗體檢測,操作步驟：半抗原機制,1. 將血小板包被在微孔板上，洗板3次2. 加入兩滴低離子強度溶液3. 加入三滴已加

34、入不同濃度藥物的BSA溶液4. 37℃氣育30分鐘5. 洗板3次6. 向相應(yīng)孔中加入兩滴低離子強度溶液，待檢標(biāo)本、對照表本；陽性對照、陰性對照對照孔中分別加入試劑盒中的陽性對照、陰性對照（每種藥物濃度均做陽性對照、 陰性對照）7. 37℃氣育45分鐘8. 洗板5次9. 立即加入抗人IgG及指示紅細(xì)胞，混勻10. 離心，觀察結(jié)果,藥物性抗體檢測,總 結(jié),1.血小板表面有復(fù)雜的抗原系統(tǒng)，能夠刺激機體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，導(dǎo)致自身