同種異體骨移植修復(fù)過程中轉(zhuǎn)化生長因子β表達(dá)的實驗研究

1、,同種異體骨移植修復(fù)過程中轉(zhuǎn)化 生長因子β1表達(dá)的實驗研究,梁炳生 關(guān)海山山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院骨科,前 言,轉(zhuǎn)化生長因子β1（ TGF-β1）是一種多肽類多功能生長因子，可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞或瘤細(xì)胞的生長分化，在骨組織中受損傷刺激可啟動新生骨與軟骨的生成。動物實驗證明，外源性TGF-β1能夠促進(jìn)骨折愈合。目前認(rèn)為，TGF-β1表達(dá)量的變化可直接反映成骨能力的強(qiáng)弱，其基因表達(dá)信號的強(qiáng)弱可反映生成量的多少。,本研究

2、采用免疫組化和原位雜交方法，觀察分析同種異體骨移植修復(fù)過程中，術(shù)后時間、移植骨處理以及供受體間主要組織相容性抗原是否相配等因素對移植骨局部內(nèi)源性TGF-β1表達(dá)的影響，旨在為進(jìn)一步研究異體骨移植愈合機(jī)理以及臨床合理使用重組生長因子提供實驗依據(jù)。,材料與方法,本研究采用2×2×4三因素析因試驗設(shè)計方法。根據(jù)供受體間主要組織相容性抗原是否相配將實驗動物隨機(jī)分為兩個大組，即主要組織相容性抗原相配組和不配組。各大組再隨機(jī)分為

3、兩個處理組，分別是新鮮異體骨移植組和冷凍異體骨移植組。,一、實驗設(shè)計,表1：實驗動物分組情況及處理,二、實驗動物選擇 選用健康、成年近交系LEW大鼠 （主要組織相容性復(fù)合體單倍體型Rt.1l）和近交系DA大鼠（主要組織相容性復(fù)合體單倍體型Rt.1a），雄性，體重270-320克。 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供。,三、移植骨的制備 LEW和DA大鼠各12只做為供體。無菌條件下取其雙側(cè)股骨，除去骨髓及附著軟組織， 修剪成3

4、mm×4mm形狀規(guī)則的半管狀皮質(zhì)骨塊，0.9%氯化鈉注射液反復(fù)沖洗。 將其中24塊皮質(zhì)骨（LEW、DA大鼠股骨各12塊）裝入雙層無菌血漿袋中，熱壓封口，置入-20℃低溫冰箱中凍存2周， 制成冷凍異體骨，植入前浸于30-37℃的0.9％氯化鈉注射液中復(fù)溫30分鐘。 將另外24塊皮質(zhì)骨做為新鮮異體骨，在2小時內(nèi)植入受體。,四、動物模型建立 LEW大鼠48只做為受體。0.6%戊巴比妥鈉（5ml /kg）腹腔注射麻醉，腹臥位

5、固定，左后肢前外側(cè)切口，長約3cm，切開皮膚、皮下組織，沿肌間隙分離，暴露股骨中段，口腔科高速裂鉆截骨， 造成股骨干中段3mm×4mm大小的骨缺損模型。 將移植骨正位植入后，逐層縫合傷口。,五、主要試劑 TGF-β1免疫組化試劑盒及TGF-β1原位雜交試劑盒（武漢博士德生物工程公司提供）。,,,六、觀察方法 取材后組織標(biāo)本以10%中性福爾馬林固定48-72小時；10%EDTA脫鈣2周，梯度酒精脫水，二甲苯透明，

6、石蠟包埋，5um連續(xù)切片，分別進(jìn)行HE染色，TGF-β1免疫組化染色及原位雜交檢測。光鏡下觀察各組移植骨修復(fù)情況。,將已判定為陽性的組織切片，隨機(jī)抽樣做空白對照，以PBS緩沖液代替一抗或雜交液。其他步驟不變。以空白對照實驗的染色程度確定是否陽性, ≤空白實驗染色強(qiáng)度為陰性,>空白對照染色強(qiáng)度為陽性。陽性表達(dá)以組織和/或細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為判斷標(biāo)準(zhǔn)。以乳腺癌標(biāo)本作為陽性對照。,七、圖像分析和統(tǒng)計學(xué)方法 1．骨組織形態(tài)計

7、量分析 每張HE染色組織切片隨機(jī)選取5視野，經(jīng)計算機(jī)自動圖像處理系統(tǒng)計算新生骨組織密度。 新生骨組織密度=新生骨組織面積/總骨面積。 2．TGF-β1原位雜交結(jié)果圖像分析 將原位雜交組織切片隨機(jī)選取 5個視野，經(jīng)計算機(jī)自動圖像處理系統(tǒng)提取圖中表達(dá)陽性信號彩色閾值，計算平均光密度值。,,以上數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理采用SAS軟件，進(jìn)行2×2×4析因方差分析。 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P﹤

8、0.05有顯著性差異。,結(jié) 果,一、組織學(xué)觀察 ※ 主要組織相容性抗原相配的新鮮異體骨移植： ⑴ 骨吸收不明顯，死骨含量少。 ⑵ 術(shù)后1周，移植骨表面、髓腔及移植骨-宿主骨間隙有新生骨樣組織生成；2周時，移植骨淺表處生成編織骨；4周，板層骨與編織骨摻雜出現(xiàn)； 8周，板層骨排列整齊與移植骨緊密地整合在一起，髓腔再通。 ⑶ 上述部位增殖、分化的成骨細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)TGF-β1蛋白及mRNA表達(dá)陽性。,※

9、 主要組織相容性抗原相配的冷凍異體骨移植： ⑴ 移植骨邊緣有骨吸收現(xiàn)象，骨內(nèi)有死骨成分。 ⑵ 術(shù)后第2周，移植骨周圍、髓腔及移植骨-宿主骨間隙有新生骨樣組織出現(xiàn)；4-8周時，板層骨、編織骨摻雜出現(xiàn)且位置表淺，髓腔內(nèi)有殘余骨小梁。 ⑶ 移植骨周圍、髓腔及移植骨-宿主骨間隙增殖、分化的成骨細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)TGF-β1蛋白及mRNA表達(dá)陽性。,※ 主要組織相容性抗原不配的新鮮異體骨移植： ⑴ 骨吸收活躍，且移

10、植骨周圍有大量多核巨細(xì)胞浸潤。 ⑵ 術(shù)后2周， 移植骨邊緣及髓腔內(nèi)有少量新生骨樣組織出現(xiàn)；至8周時，新生骨組織很少，移植骨內(nèi)仍有大片均質(zhì)狀死骨。髓腔無再通跡象。 ⑶ 上述部位增殖、分化的成骨細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)TGF-β1蛋白及mRNA表達(dá)陽性。,,※ 主要組織相容性抗原不配的冷凍異體骨移植： ⑴ 移植骨邊緣有骨吸收現(xiàn)象，骨內(nèi)有死骨成分。 ⑵ 術(shù)后2周，新生骨樣組織出現(xiàn)； 4-8周時，板層骨、編織骨摻雜出現(xiàn)

11、，位置表淺，與移植骨整合不緊密，髓腔內(nèi)有殘余骨小梁。 ⑶ TGF-β1蛋白及mRNA表達(dá)主要定為于新生骨組織表面的成骨細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)。,,圖1．術(shù)后2周，主要組織相容性抗原相配的新鮮異體骨移植（HE ×100）圖2．術(shù)后2周，主要組織相容性抗原相配的冷凍異體骨移植（HE ×100）圖3．術(shù)后2周，主要組織相容性抗原不配的新鮮異體骨移植（HE ×100）圖4．術(shù)后2周，主要組織相容性抗

12、原不配的冷凍異體骨移植（HE ×100）,圖 1 圖 2,圖 3 圖 4,圖 5．術(shù)后1周，主要組織相容性抗原相配的新鮮異體骨移植（ISH ×100）圖 6．術(shù)后1周，主要組織相容性抗原相配的冷凍異體骨移植（ISH ×100）圖 7．術(shù)后2周，主要

13、組織相容性抗原不配的新鮮異體骨移植（ISH ×100）圖 8. 術(shù)后2周，主要組織相容性抗原不配的冷凍異體骨移植（ISH ×100）,圖 7 圖 8,圖 5 圖 6,圖 9 圖 10,圖 11

14、 圖 12,2,圖 9．術(shù)后4周，主要組織相容性抗原相配的新鮮異體骨移植（IHC ×100）圖 10．術(shù)后4周，主要組織相容性抗原相配的冷凍異體骨移植（IHC ×100）圖 11．術(shù)后8周，主要組織相容性抗原不配的新鮮異體骨移植（IHC ×100）圖 12．術(shù)后8周，主要組織相容性抗原不配的冷凍異體骨移植（IHC ×100）,1．隨時間延長

15、新生骨組織密度逐漸增高，術(shù)后第8周新生骨組織密度最高（P﹤0.05）。 2．主要組織相容性抗原相配與不配者之間新生骨組織密度有顯著性差異（P﹤0.05）。,二、骨組織形態(tài)計量分析,3．冷凍異體骨移植與新鮮異體骨移植之間新生骨組織密度有顯著性差異（P﹤0.05）。 4. 主要組織相容性抗原相配的新鮮異體骨移植新生骨組織出現(xiàn)最早，成骨效果最好，術(shù)后8周與其他各移植骨相比新生骨組織密度最高（P<0.05）。,,表2

16、 骨組織形態(tài)分析結(jié)果,,主要組織相容性抗原相配 主要組織相容性抗原不配時間(周) 新鮮異體骨 冷凍異體骨 新鮮異體

17、骨 冷凍異體骨 1 0.2000±0.0033 0.1392±0.0029 0.1070±0.0032 0.1411±0.0073 2 0.5236±0.0188 0.3673±0.0196 0.1537±0.0065 0.3701±0.0020 4 0.6193&#

18、177;0.0174 0.4815±0.0135 0.2118±0.0024 0.4326±0.0238 8 0.7615±0.0200 0.7030±0.0106 0.3063±0.0159 0.6989±0.0096,,,,,,,,,,1 2 4 8,圖13

19、 骨組織形態(tài)計量分析結(jié)果,時間（周）,,1．供受體間主要組織相容性抗原是否相配影響TGF-β1mRNA的表達(dá)強(qiáng)度（P<0.05）。 2．移植骨冷凍處理影響TGF-β1mRNA的表達(dá)強(qiáng)度(P<0.05)。 3．術(shù)后時間影響TGF-β1mRNA的表達(dá)強(qiáng)度（P<0.05）。術(shù)后8周時TGF-β1mRNA表達(dá)水平最低。 4．時間、移植骨處理以及主要組織相容性抗原是否相配等因素之間存在交互作用（P&l

20、t;0.05）。,三、TGF-β1mRNA原位雜交檢測圖像分析,,主要組織相容性抗原相配 主要組織相容性抗原不配 時間(周) 新鮮異體骨 冷凍異體骨 新鮮異體骨 冷凍異體骨 1 1.4175±0.0029 0.9985±0.0144 0.2

21、409±0.0075 0.4554±0.0128 2 0.8470±0.0085 0.7087±0.0016 0.2591±0.0015 1.0544±0.1224 4 0.6102±0.0035 0.4994&

22、#177;0.0017 0.2533±0.0103 0.4883±0.0161 8 0.4750±0.0047 0.4196±0.0018 0.2438±0.0061 0.4217±0.0187,,,,,,表3 術(shù)后不同時間各移植骨TGF-β1mRNA表達(dá)強(qiáng)度（平均

23、光密度值）,影響因素 F值 P值 主要組織相容性抗原(A) 1277.55 <0.05 移植骨處理(B) 71.19 <0.05 術(shù)后觀察時間(T) 449.16 <0.05 A×B

24、887.30 <0.05 B×T 67.89 <0.05 A×T 393.78 <0.05 A×B×T 30.99 <0.05,,表4 2×2×4

25、析因分析結(jié)果,,,1 2 4 8,時間（周）,圖14 術(shù)后不同時間各移植骨TGF-β1表達(dá)強(qiáng)度（平均光密度值）,,討 論,一、骨移植修復(fù)過程中TGF-β1的表達(dá)特征 目前已經(jīng)知道，骨損傷修復(fù)過程中，TGF-β1早期主要源于血小板和局部血液凝固。 血小板脫顆粒釋放TGF-β1，刺激修復(fù)細(xì)胞如間充質(zhì)細(xì)胞，成骨細(xì)胞增殖、分化，啟動修復(fù)過程。局部的成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞可在TGF-β1的調(diào)節(jié)下使骨吸收、骨形

26、成協(xié)調(diào)進(jìn)行。,本研究發(fā)現(xiàn)，異體骨移植修復(fù)過程中，移植骨局部TGF-β1的表達(dá)水平與成骨效果協(xié)同變化，隨骨組織逐漸成熟而發(fā)生量的變化， 呈現(xiàn)出由高到低的緩慢下降趨勢，提示了在移植骨修復(fù)過程中，局部內(nèi)源性TGF -β1對骨形成、骨改建起著重要調(diào)節(jié)作用， 它可以根據(jù)損傷修復(fù)所需的生物學(xué)環(huán)境而發(fā)生量與分布的變化。,,,現(xiàn)已證實，TGF-β1可誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞向成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化， 以軟骨內(nèi)成骨或膜內(nèi)成骨的方式成骨。 本研究觀察到，異體骨移植

27、成骨過程主要是以膜內(nèi)成骨方式進(jìn)行，軟骨內(nèi)成骨很少。 原位雜交結(jié)果顯示，在膜內(nèi)成骨階段TGF-β1mRNA表達(dá)量最高，隨即呈現(xiàn)出下降趨勢。,,這可能是骨移植時局部出血較少，有氧環(huán)境利于間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，以膜內(nèi)成骨的方式形成骨組織。這與骨折愈合過程中， 局部TGF-β1mRNA的表達(dá)特征明顯不同，即沒有與軟骨內(nèi)成骨階段有關(guān)的第二次峰值出現(xiàn)。,,,二、免疫排斥反應(yīng)抑制TGF-β1的表達(dá) 本研究表明，主要組織相容性抗原不配的同種

28、異體骨移植的成骨效果明顯不如組織抗原相配者。原位雜交結(jié)果也顯示出同樣的抑制特征。這說明供受體間主要組織相容性抗原不配抑制骨移植的修復(fù)過程以及局部內(nèi)源性TGF-β1的表達(dá)。這一結(jié)論與以往研究結(jié)果是一致的。,,研究證明，骨細(xì)胞膜及細(xì)胞外骨基質(zhì)中含有大量I、II類抗原分子。異體骨移植可以呈遞抗原，誘發(fā)宿主產(chǎn)生以局部細(xì)胞免疫反應(yīng)為主的排斥反應(yīng)，導(dǎo)致移植骨周圍炎性細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管狹窄、閉塞，移植骨修復(fù)過程延遲或移植骨被超前吸收。,,同時，免疫排

29、斥反應(yīng)過程中還產(chǎn)生了許多細(xì)胞因子，如IL-1，TNF-α等，它們除參與免疫調(diào)節(jié)外，還可激活破骨細(xì)胞的活性促進(jìn)破骨并抑制成骨。體外研究發(fā)現(xiàn)，IL-1，TNF-α可以促進(jìn)FAS介導(dǎo)的人類成骨細(xì)胞凋亡，抑制TGF-β1的表達(dá)。,,盡管同種異體骨植入體內(nèi)后，處于一個低水平的免疫反應(yīng)狀態(tài)，不存在異體器官移植所出現(xiàn)的超急性排斥反應(yīng)，但仍會給骨修復(fù)、塑型、重建帶來不利影響，反映在分子水平上表現(xiàn)為 TGF-β1 表達(dá)水平的降低或延遲。,三、移植骨冷凍處

30、理對TGF-β1表達(dá)的影響 現(xiàn)已證實，異體骨經(jīng)低溫冷凍處理后可以降低其免疫原性，但同時其生物學(xué)活性也被減弱。這一現(xiàn)象的發(fā)生可能是移植骨內(nèi)存活細(xì)胞死亡造成的。因為低溫冷凍處理對移植骨而言，不僅僅是一個低溫儲藏的過程，植入前移植骨往往需要解凍，凍融的變化過程在改變抗原結(jié)構(gòu)的同時，也會引起骨內(nèi)存活細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞導(dǎo)致骨內(nèi)細(xì)胞死亡。,本研究結(jié)果顯示，低溫冷凍處理對主要組織相容性抗原相配與不配的異體骨移植會造成兩種截然不同的結(jié)局：對組織抗

31、原相配者而言，表現(xiàn)為骨摻入延遲，TGF-β1mRNA表達(dá)水平降低；而對于組織抗原不配者，則表現(xiàn)為骨摻入加快，TGF-β1mRNA表達(dá)水平增高，并且在術(shù)后第2周達(dá)到高峰。這也說明了低溫冷凍造成骨內(nèi)存活細(xì)胞死亡以及細(xì)胞膜破壞，使與膜結(jié)構(gòu)有關(guān)的抗原結(jié)構(gòu)改變，移植物免疫原性下降。,以往研究表明，移植骨的生物學(xué)作用主要體現(xiàn)在以下三個方面：一是提供移植骨本身內(nèi)在的生物學(xué)活性物質(zhì)，即骨內(nèi)存活細(xì)胞及其產(chǎn)物；二是骨基質(zhì)內(nèi)活性生長因子誘導(dǎo)宿主來源的未分化間

32、充質(zhì)細(xì)胞成骨，即骨誘導(dǎo)作用；三是充當(dāng)宿主新生骨組織長入的支架，即骨傳導(dǎo)作用。,本研究觀察到，在冷凍異體骨移植物的周圍及靠近邊緣的部位有新生骨組織形成，同時局部也有TGF-β1mRNA及蛋白質(zhì)存在。 證明了冷凍異體骨移植，后兩種成骨途徑是可能的。但是這種源于骨吸收后細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)細(xì)胞因子的成骨將是十分緩慢的，并且新生骨組織總是出現(xiàn)在移植骨表淺的部位，不會與移植骨很好地整合在一起。,Enneking等也發(fā)現(xiàn)冷凍骨內(nèi)部“爬行替代”主要發(fā)生在移植

33、骨淺表面及兩端，移植后5年，移植骨僅有20%被新骨替代，深層未修復(fù)部分仍保持原結(jié)構(gòu)。,四、多種因素交互作用影響TGF-β1的表達(dá) 同種異體骨移植修復(fù)過程中，時間、移植骨處理以及主要組織相容性抗原是否相配等因素相互作用影響移植骨局部內(nèi)源性TGF-β1mRNA的表達(dá)。本研究證實，主要組織相容性抗原相配的新鮮異體骨移植，在術(shù)后1周TGF-β1 mRNA表達(dá)強(qiáng)度最高，并且新生骨組織出現(xiàn)最早，成骨效果最好。,本研究發(fā)現(xiàn)，主要組織相容性抗原

34、相配的異體骨在冷凍以后，移植骨局部TGF-β1 mRNA表達(dá)降低，而組織抗原不配者則相反。說明主要組織相容性抗原是否相配與移植骨冷凍處理交互作用影響 TGF-β1mRNA的表達(dá)。此外，對于新鮮異體骨而言，主要組織相容抗原差異是影響TGF-β1 mRNA表達(dá)的關(guān)鍵因素，對于冷凍異體骨而言，主要組織相容性抗原差異的影響就顯得不甚重要了。,,五、結(jié)語 1．同種異體骨移植的修復(fù)過程是一個復(fù)雜的生物學(xué)行為，單一生長因子并不能解釋其全

35、部內(nèi)容。關(guān)于其它因子的表達(dá)以及局部應(yīng)用生長因子促進(jìn)骨修復(fù)等問題還有待于進(jìn)一步研究。,,,2．本研究采用免疫組化染色和原位雜交技術(shù)檢測移植骨修復(fù)過程中修復(fù)細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外TGF-β1的表達(dá)及分布情況，從蛋白質(zhì)水平及mRNA水平測到 TGF-β1 在相應(yīng)細(xì)胞內(nèi)存在，可以完整地說明該細(xì)胞因子在相應(yīng)細(xì)胞中從頭合成并經(jīng)加工處理產(chǎn)生有活性因子。,,結(jié) 論,1．本研究證明，在移植骨修復(fù)過程中，局部內(nèi)源性TGF-β1對骨形成，骨改建起著重要調(diào)節(jié)作用，

36、它可以根據(jù)損傷修復(fù)所需的生物學(xué)環(huán)境而發(fā)生量與分布的變化。 2．同種異體骨移植修復(fù)過程中，供受體間主要組織相容性抗原不配抑制局部內(nèi)源性TGF-β1表達(dá)，在組織形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為移植骨修復(fù)過程的延遲或抑制。,3．異體骨移植物經(jīng)低溫冷凍后可以減弱其免疫原性，但同時也會造成其生物學(xué)活性的降低。 4．同種異體骨移植修復(fù)過程中，時間、移植骨的處理以及供受體間主要組織相容性抗原是否相配等因素相互作用影響移植骨局部內(nèi)源性TGF-β1mR