遺傳病的診斷和治療

1、遺傳病的診斷和治療,遺傳病的診斷,一般診斷（病史、癥狀、體征、實驗室）特殊診斷（系譜分析、染色體檢查、特殊生化檢測、基因診斷）現(xiàn)癥診斷、癥狀前診斷、產(chǎn)前診斷,現(xiàn)癥診斷,一、病史、癥狀和體征 1、病史： 家族史、婚姻史、生育史 2、癥狀和體征： 特異性癥候群：PKU、半乳糖血癥、性染色體病,二、系譜分析,從先證者入手，調(diào)查其親屬的健康及生育狀況，將調(diào)查材料繪制成系譜圖進(jìn)行系譜分析。由

2、于各種單基因遺傳病常表現(xiàn)出特定的孟德爾式遺傳，所以，系譜分析常有助于單基因病的診斷。,三、細(xì)胞遺傳學(xué)檢查,是較早應(yīng)用于遺傳病診斷的輔助手段，能較準(zhǔn)確地判斷和發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常綜合征，因而該方法是確診染色體病的主要方法。,1．染色體檢查 亦稱核型分析（karyotype analysis）,是確診染色體病的主要方法。隨著顯帶技術(shù)的應(yīng)用以及高分辯率染色體顯帶技術(shù)的出現(xiàn)和改進(jìn)，能更準(zhǔn)確地判斷和發(fā)現(xiàn)更多的染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常

3、綜合征，還可以發(fā)現(xiàn)新的微畸變綜合征。,2．性染色質(zhì)檢查,優(yōu)點是方法簡單，主要用于疑為兩性畸形或性染色體數(shù)目異常的疾病診斷或產(chǎn)前診斷，有一定價值，但確認(rèn)仍需依靠染色體檢查。,3、染色體原位雜交：,應(yīng)用標(biāo)記的DNA片段與玻片上的細(xì)胞、染色體或間期核的DNA雜交，在樣品核酸不改變其結(jié)構(gòu)和分布格局的情況下，研究核酸片段的位置、相互關(guān)系。,4、熒光原位雜交（FISH）：,應(yīng)用熒光素標(biāo)記的DNA探針與標(biāo)本進(jìn)行原位雜交后，使雜交區(qū)域發(fā)出熒光。優(yōu)點

4、：快速、安全 靈敏度高 特異性強。 圖示為18三體綜合征患者的FISH檢測,染色體檢查的指征：,①有明顯的智力發(fā)育不全、生長遲緩或伴有其他先天畸形者；②夫婦之一有染色體異常，如平衡結(jié)構(gòu)重排、嵌合體等；③家族中已有染色體或先天畸形的個體；④多發(fā)性流產(chǎn)婦女及其丈夫；⑤原發(fā)性閉經(jīng)和女性不育癥；⑥無精子癥男子和男性不育癥；⑦兩性內(nèi)外生殖畸形者；⑧疑為先天愚型的患兒及其父母；⑨原因不明的智力低下伴有大耳、大睪丸

5、和（或）多動癥者；⑩35歲以上的高齡孕婦（產(chǎn)前診斷）。,四、生化檢查,生化檢查主要用于生化遺傳病的檢測。主要針對三方面：1）蛋白、酶活性；2）反應(yīng)底物、代謝中間產(chǎn)物或終產(chǎn)物的濃度；3）受體的結(jié)合能力。例如疑為苯酮尿癥患者，可檢測血清苯丙氨酸或尿中苯乙酸濃度；粘多糖病可測定尿中硫酸皮膚素、硫酸乙酰肝素等。,五、基因診斷,采用分子生物學(xué)方法在DNA水平或RNA水平對某一基因進(jìn)行分析，從而對特定的疾病進(jìn)行診斷。,特 點：,針對直接病因診斷

6、特異性強，靈敏度高適應(yīng)性強，診斷范圍廣目的基因是否處于活化狀態(tài)均可，無組織和發(fā)育特異性。在感染性疾病的基因診斷中，可檢測正在生長的病原體或潛伏病原體。,基因診斷的樣本：,可以是任何有核細(xì)胞，包括：1、外周血白細(xì)胞、口腔粘膜細(xì)胞2、活檢標(biāo)本、石臘包埋的組織塊3、沉淀細(xì)胞（唾液、痰液、尿液）4、羊水細(xì)胞、絨毛細(xì)胞、 進(jìn)入母體循環(huán)的胎兒細(xì)胞應(yīng)用PCR，樣本可微量化到一個細(xì)胞,,基因診斷的基本技術(shù)：,核酸分子雜交

7、聚合酶鏈反應(yīng)PCRDNA測序技術(shù),Southern blot印跡雜交,通過用已知基因的DNA片段制備探針與待測基因組DNA的限制性酶切片段進(jìn)行雜交，分析帶譜。可直接確定致病基因的缺陷。是最經(jīng)典、應(yīng)用最廣泛的分子遺傳學(xué)技術(shù)。常用于基因缺失。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,aa/aa aa/- aa/a- a-/-- --/-,14kb10kb,,,,,10kb 4kb,B

8、amH I,BamH I,左側(cè)：16號染色體上攜有數(shù)目不同的基因右側(cè)：a基因探針雜交的結(jié)果,?-地貧基因缺失的診斷,正常,貧血癥狀,攜帶者,HbH,限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析：,RFLP：DNA順序上發(fā)生變化而出現(xiàn)或丟失某一限制性內(nèi)切酶位點，使酶切產(chǎn)生的片段長度和數(shù)量發(fā)生變化。RFLP分析：利用RFLP與DNA Southern印跡雜交結(jié)合對遺傳病作出診斷和分析的方法。,鐮狀貧血的基因診斷：,,,IVS-I,,,,,,,

9、,,,,,,,,,,,1.35kb1.15kb,正常 鐮性 鐮狀 性狀 貧血,,,,,Mst II,1.15kb,1.15kb,1.35kb,IVS-II,β珠蛋白基因,Polymerase Chain Reaction (PCR),A method to amplify specific genetic sequences

10、.,,,,,,,,,,,Template (DNA or RNA)Two primersdNTPsPCR bufferKCl, Tris, MgCl2Thermostable DNA Polymerase (Taq),PCR Reagent Components,,,,,,,,,,,,,,,PCR Cycle：,STEPS,Denaturation: DNA strandsseparate.94oC,Annealing:

11、 Primers bind toDNA.65-40oC,Extension: New DNA issynthesized.72oC,,,,,,,,,,,,Cycle 1,Cycle 2,Cycle 3,Geometric Amplification：,,After 30 cycles, theDNA is amplifiedover a billion fold.,,基于PCR技術(shù)的DNA診斷,PCR直接擴(kuò)增（大片段缺失

12、）PCR/ASO、PCR/SSCP、PCR/DGGE聯(lián)合應(yīng)用（點突變的檢測)PCR/Southern blot 聯(lián)合應(yīng)用（三核苷酸重復(fù)相關(guān)遺傳病）,多重PCR：在同一PCR體系中加入數(shù)對PCR引物，可同時擴(kuò)增多個DNA片段。常用來檢測同一基因的多個外顯子的缺失。,PCR/ASO探針斑點雜交：,常用于檢測點突變。等位基因特異性寡核苷酸（ allele-specific oligonucleotide，ASO）：人工合成的長約20

13、個核苷酸的DNA片段，其序列與所研究基因的相應(yīng)區(qū)段互補。,Single Strand Conformation Polymorphisms,Gene,PCR,DenatureQuick cool,,,,Non-denaturing gel.Slow run.Cool.,PCR SSCP：,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,PCR DGGE：,,Denaturing Gradient Gel Polymorphis

14、ms,PCR/Southern blot 聯(lián)合應(yīng)用檢測三核苷酸重復(fù)相關(guān)遺傳?。?DNA測序法：,DNA測序（DNA Sequencing)是檢測未知突變和已知突變基因的最基本和最重要的實驗手段。,基因芯片,又稱DNA芯片，（DNA array）.指把成千上萬個寡核苷酸或cDNA探針密集、規(guī)律地排列在1cm2大小的硅片或玻璃芯片上，容量可達(dá)20～40萬個基因探針。將熒光標(biāo)記的DNA或cDNA樣品送到在芯片上與探針雜交，經(jīng)激光共聚焦顯微鏡

15、掃描，以計算機(jī)系統(tǒng)對熒光信號做出比較和檢測，可迅速得出所需的信息，比常規(guī)方法快幾十到幾千倍。,,,DNA microarrays on glass slides,表達(dá)譜芯片和寡核苷酸芯片,表達(dá)譜芯片工作原理：,提取RNACy3標(biāo)記對照組，Cy5標(biāo)記實驗組?；旌蟽煞N探針，與芯片雜交掃描儀以兩種波長激光掃描，532nm探測Cy3，633nm探測Cy5。Red：明顯上調(diào)；green：明顯下調(diào)，yellow：差異不顯著。Cy5/Cy3

16、的比率（0.5-2.0)。,寡核苷酸芯片工作原理：,由于DNA鏈短（20-30nt），單個堿基錯配可以降低雜交鏈的穩(wěn)定性，Tm值降低5-10控制雜交條件：時間、溫度、鹽濃度等，可以使完全匹配和單堿基錯配的雙鏈雜交幾率明顯不同。提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增并用熒光標(biāo)記，與芯片雜交，可以判斷待測樣品同芯片上哪個片段結(jié)合，可知待測DNA序列上特定位點的堿基特征。,℃,基因芯片應(yīng)用,基因芯片是生物芯片研究中，最先實現(xiàn)商品化的產(chǎn)品。

17、60;  *尋找新基因           *DNA測序   *疾病診斷              *藥物篩選   *毒理基因組學(xué)        *農(nóng)

18、作物優(yōu)育和優(yōu)選   *環(huán)境檢測和防治    *食品衛(wèi)生監(jiān)督    *司法鑒定,基因診斷是基因芯片中最具有商業(yè)化價值的應(yīng)用,從正常人的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交就可以得出標(biāo)準(zhǔn)圖譜。從病人的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交就可以得出病變圖譜。通過比較、分析這兩種圖譜，就可以得出病變的DNA信息。這種基因芯片診斷技術(shù)以其快速、高效、敏感、經(jīng)濟(jì)、平行化、自動化等特點

19、，將成為一項現(xiàn)代化診斷新技術(shù)。,應(yīng)用實例,Affymetrix公司，把P53基因全長序列和已知突變的探針集成在芯片上，制成P53基因芯片，將在癌癥早期診斷中發(fā)揮作用。Heller等構(gòu)建了96個基因的CDNA微陣，用于檢測分析風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)相關(guān)的基因，以探討DNA芯片在感染性疾病診斷方面的應(yīng)用?，F(xiàn)在，肝炎病毒檢測診斷芯片、結(jié)核桿菌耐藥性檢測芯片、多種惡性腫瘤相關(guān)病毒基因芯片等一系列診斷芯片逐步開始進(jìn)入市場。,G6PD缺乏癥檢測芯

20、片,由G6PD基因的突變、插入和缺失引起。根據(jù)已知的基因突變型可設(shè)計突變基因探針，制成芯片可同時檢測中國人種的8種突變類型，覆蓋率達(dá)90%以上，并能精確確定突變類型及純、雜合狀況。操作時間短（4小時以內(nèi)），適于大批量檢定。,基因芯片的其他臨床應(yīng)用：,HLA分型地中海貧血檢測乙肝耐藥性檢測,癥狀前診斷,針對一些發(fā)病較遲的常染色體顯性遺傳病患者在出現(xiàn)癥狀或生育前對其作出診斷。 基因診斷是癥狀前診斷的主要手段。,產(chǎn)前診斷,是對胚胎

21、或胎兒是否患有遺傳病或先天畸形在出生前進(jìn)行的診斷,母嬰保健法規(guī)定：,第二十條 孕婦有下列情形之一的，醫(yī)師應(yīng)當(dāng)對其進(jìn)行產(chǎn)前診斷：    （一）羊水過多或者過少的；    （二）胎兒發(fā)育異?；蛘咛河锌梢苫蔚模?#160;   （三）孕早期接觸過可能導(dǎo)致胎兒先天缺陷的物質(zhì)的；    （四）有遺傳病家族史或者曾經(jīng)分娩過先天性

22、嚴(yán)重缺陷嬰兒的；    （五）初產(chǎn)婦年齡超過35周歲的。,產(chǎn)前診斷的方法,1、非侵襲方法母親血清、尿液的生化檢查B超2、侵襲性方法：根據(jù)妊娠時間及檢測目的有針對性地選用不同的穿刺取樣技術(shù)，然后將樣品進(jìn)行實驗室檢查（細(xì)胞遺傳學(xué)、生化檢查、基因診斷）。羊膜穿刺術(shù)、絨毛吸取術(shù) 、 臍帶穿刺術(shù),取樣方法 取樣時間 待測樣品 羊膜穿刺術(shù) 孕16-20周

23、 脫落細(xì)胞絨毛吸取術(shù) 孕7-9周 絨毛膜細(xì)胞臍帶穿刺術(shù) 孕18周 臍帶血細(xì)胞,,,,,羊膜穿刺術(shù)：,羊膜穿刺術(shù)指征：,高齡孕婦異常的母體血清三倍體標(biāo)記篩查結(jié)果染色體異常家族史神經(jīng)管缺損/異常母體血清甲胎蛋白生化檢查或DNA分析檢測的孟德爾遺傳病,絨毛吸取術(shù),,新進(jìn)展：著床前診斷,在受精6天胚胎著床前進(jìn)行。優(yōu)點：即可避免分娩患兒，又不必行流產(chǎn)

24、術(shù),胚胎移植前遺傳病診斷preimplantation genetic diagnosis, PGD,PGD是在體外受精（in-vitro fertilization, IVF）技術(shù)、分子生物學(xué)和顯微操作的基礎(chǔ)上，對受精三天后的胚胎在種植前，檢查其正常后再移植到子宮的一項新技術(shù)，也即所謂第三代試管嬰兒技術(shù)。一般在卵裂期，當(dāng)胚胎發(fā)育到6-8個細(xì)胞階段，抽取1-2個細(xì)胞，進(jìn)行遺傳疾病診斷。根據(jù)遺傳診斷結(jié)果，僅將正常胚胎移植至子宮,,PG

25、D的應(yīng)用：,該技術(shù)由英國Handyside醫(yī)生小組首創(chuàng)，于1990年第1例妊娠成功。目前PGD已成功應(yīng)用于以下疾?。虹犘渭t細(xì)胞貧血、血友病、囊性纖維增生癥、地中海貧血和自毀容貌綜合征等。1997年1月至1998年9月有66例臨床妊娠 .,遺傳病的治療,常規(guī)治療包括：手術(shù)治療、飲食、藥物控制和物理療法。近十年隨著人們對遺傳病發(fā)病機(jī)制的逐漸深入及分子生物學(xué)技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的廣泛應(yīng)用，使遺傳病的治療從常規(guī)治療跨入了基因治療，為根治遺傳病帶來了希望

26、。,,一、常規(guī)治療,1、手術(shù)治療手術(shù)矯正畸形改善癥狀（切脾：遺傳性溶血?。?器官和組織移植：重型地中海貧血、遺傳性角膜萎縮、a1抗胰蛋白酶缺乏）,2、藥物及飲食治療,補其所缺激素替代療法：生長激素、胰島素生化遺傳病的補缺：蛋白、酶或反應(yīng)終產(chǎn)物 禁其所忌：PKU 、半乳糖血癥 去其所余促排泄劑：消膽胺代謝抑制劑：別嘌呤醇螯合劑：D-青霉胺平衡清除法：溶酶體儲積癥換血或血漿過濾,二、基因治療,指應(yīng)用DNA重組技術(shù)，更

27、換、修正或替代患者細(xì)胞中有缺陷的致病基因，糾正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病，以達(dá)到治療的目的?；蛑委熆煞譃椋荷臣?xì)胞基因治療體細(xì)胞基因治療,基因治療的歷史：,60年代 Edward Tatum提出在基因水平上糾正缺陷基 因是遺傳病治療的根本途徑。1966年 美國國立實驗室的Rogers發(fā)現(xiàn)，接觸兔乳頭 狀病毒的實驗工作人員中相當(dāng)部分的血精氨 酸降低。推測病毒核酸進(jìn)入細(xì)胞

28、使精氨酸酶 活性升高。1973年 Rogers用shope兔乳頭狀瘤病毒感染一個患 有精氨酸血癥女孩的皮膚成纖維細(xì)胞，使細(xì) 胞精氨酸酶活性上升，且可持續(xù)7個月。,基因治療的歷史：,1980年 美國Cline等將正常人的?珠蛋白質(zhì)基因轉(zhuǎn) 入兩名重型?地中海貧血患者的骨髓細(xì)胞 并經(jīng)靜脈輸回體內(nèi)。兩名患者存活6年。1989年 美國NIH正式批準(zhǔn)國立癌癥

29、研究所(NCI)和 Rosenberg等進(jìn)行5例標(biāo)志基因的人體轉(zhuǎn)移 試驗。,基因治療的歷史：,1990年11月 美國NIH的Blease和culver進(jìn)行了首例人 體基因治療臨床試驗?；糀DA缺乏癥的4 歲小女孩，利用反轉(zhuǎn)錄病毒將ADA基因轉(zhuǎn) 移到T淋巴細(xì)胞中，再回輸。患者免疫力 明顯提高，取得了巨大成功。

30、1991年12月 我國復(fù)旦大學(xué)與長海醫(yī)院合作進(jìn)行世界 上首次血友病B基因治療臨床試驗。1998年底 經(jīng)各國政府批準(zhǔn)的臨床試驗方案達(dá)329項， 已有2,557名患者接受了正規(guī)的基因治療,基因治療的類型,,（一）基因治療的策略,1、基因修正：定點導(dǎo)入外源正?；蛞源嬗腥毕?的基因，對靶細(xì)胞基因組其他部分無任何改變。2、基因替代（增強）：將有功能的正常基因轉(zhuǎn)移到疾變細(xì)胞或其他細(xì)胞基

31、因組的某個部位上，以代替或增強缺陷基因的作用。目前最常用的基因治療策略。,,（一）基因治療的策略：,3、基因開放：重新開放已關(guān)閉的基因，促使與缺陷基因有類似功能的基因表達(dá)，以代替異?；虻谋磉_(dá)。4、基因抑制：導(dǎo)入外源基因以抑制原有的有害基因表達(dá)5、基因封閉：反義RNA被稱為基因封條，能封閉 mRNA，抑制基因表達(dá)。,（二）基因治療的步驟,1、目的基因的克隆2、表達(dá)載體的構(gòu)建：為使目的基因有效表達(dá)，需在重組載體 中裝上啟動子或增強

32、子等調(diào)控元件,目前基因治療使用的載體,基因治療載體的優(yōu)缺點,,3、靶細(xì)胞的選擇,原則： 1） 耐處理，易于分離及回輸 2）具有增殖優(yōu)勢，生命周期長 3）易于轉(zhuǎn)化 4）目的基因表達(dá)的細(xì)胞特異性 常用：骨髓干細(xì)胞；皮膚成纖維細(xì)胞； 血管內(nèi)皮細(xì)胞；肝細(xì)胞,,4、目的基因的轉(zhuǎn)移：,1）在體轉(zhuǎn)移(ex vivo)：將試驗對象的細(xì)胞取出，體 外培養(yǎng)并導(dǎo)入重組基因，而后將

33、這些經(jīng)遺傳修飾 的細(xì)胞重新輸回試驗對象體內(nèi)。 特點：經(jīng)典方法。安全、效果易控制，但步驟多， 技術(shù)復(fù)雜，不容易推廣。2）活體直接轉(zhuǎn)移(in vivo)：將帶有遺傳物質(zhì)的病毒、脂質(zhì)體或裸DNA直接注射到實驗對象體內(nèi)； 特點：操作簡便、易推廣，為基因轉(zhuǎn)移的發(fā)展趨勢。,,轉(zhuǎn)移方法,①化學(xué)法：磷酸鈣共沉淀、脂質(zhì)體包埋等方法，通過改變細(xì)胞膜的通透性及增加DNA與細(xì)胞的吸附而實施基因轉(zhuǎn)移。②物理法：顯微注射技術(shù)

34、、電穿孔法、微粒子轟擊法。③生物法：病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移 常用：逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒及其相關(guān)病毒、 單純皰疹病毒等,,（三）已實施的遺傳病基因治療的代表性方案,1、T淋巴細(xì)胞為靶細(xì)胞的體外途徑 從ADA缺陷型患兒外周血中分離出單核細(xì)胞，用重組的人類單克隆抗體刺激T細(xì)胞增殖，以逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染，使ADA基因穩(wěn)定整合，擴(kuò)增T細(xì)胞后回輸。治療后患兒T細(xì)胞數(shù)上升，細(xì)胞和體液免疫功能及臨床癥狀明顯改善，隨訪5年仍可在患

35、兒體內(nèi)的T細(xì)胞中測得轉(zhuǎn)入的載體序列，其它免疫指標(biāo)檢測也證實其長期作用。,,2、以造血干細(xì)胞為靶細(xì)胞的體外途徑,2000年4月，法國科學(xué)家在《Science》上報導(dǎo)：從2名患有嚴(yán)重型免疫缺陷癥的患兒骨髓中抽取出造血干細(xì)胞，以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體將正常基因?qū)朐煅杉?xì)胞中，然后回輸給病孩。經(jīng)過10個月的隨訪獲得了較滿意的效果，患兒的免疫系統(tǒng)達(dá)到正常水平。干細(xì)胞水平的治療方案不像成熟的T細(xì)胞那樣需要反復(fù)回輸，減少了患兒反復(fù)注射的痛苦，同時基因表

36、達(dá)的水平也明顯高于以前的方案?？梢姡杉?xì)胞水平基因治療會成為今后發(fā)展的方向。,3、以皮膚成纖維細(xì)胞為靶細(xì)胞的體外途徑,應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染血友病B患者的成纖維細(xì)胞，回植到患者皮下，使患者血漿中IX因子抗原活性升高1-2倍，并持續(xù)2年以上，鼻出血等癥狀有所好轉(zhuǎn)，每年所需輸血次數(shù)減少。但轉(zhuǎn)入的IX因子表達(dá)水平仍有待進(jìn)一步提高。,（四）基因治療中存在的問題及對策,1、插入突變 為基因治療臨床試驗前首先要考慮的問題。由于基因治

37、療尚未發(fā)展到定點整合的階段，隨機(jī)整合有可能激活原癌基因或使抑癌基因失活，從而引起細(xì)胞癌變。相對而言，腺病毒對人類的安全性要高于逆轉(zhuǎn)錄病毒。,,1999年9月，1名18歲的青年在賓夕法尼亞大學(xué)的基因治療試驗中意外死亡。2002年法國連續(xù)發(fā)現(xiàn)2名接受基因療法的“氣泡兒童”出現(xiàn)了類似白血病的癥狀。美國FDA2003年1月宣布：鑒于法國接受基因治療的“氣泡兒童”患上了白血病，該局決定暫停27項類似的基因治療試驗。,,,2、免疫原性