免疫學(xué)技術(shù)免疫血清制備

1、抗體制備,,一、免疫動(dòng)物,動(dòng)物選擇：種類多。哺乳類或禽類。選擇適齡、健壯的動(dòng)物原則：需要血清量、抗原從何種種屬動(dòng)物分離獲得，需要單抗時(shí)，有多少抗原可使用。常用種類：兔、小鼠、大鼠、豚鼠、中國(guó)倉(cāng)鼠商品用動(dòng)物：豬、馬、牛、羊多抗制備常用兔（得到500ml血清?。?多克隆抗體制備,動(dòng)物選擇,,動(dòng)物 血清最大量 單抗可能性 純系 評(píng)價(jià),,兔

2、 500 有可能 否 常用于多抗制備小鼠 2 是 是 常用單抗制備大鼠 20 是

3、 是 生產(chǎn)單抗中國(guó)倉(cāng)鼠 20 否 否 抗原少時(shí)生產(chǎn)多抗豚鼠 30 否 否 難以采血雞

4、 50 否 否 對(duì)高度保守的哺乳動(dòng) 物抗原較好,,小鼠6周左右成熟，大鼠6-8周，兔12周成熟數(shù)量：小鼠3-5只，兔最少兩只,抗原及抗原劑量的選擇：所

5、用抗原應(yīng)具備抗原特異性和較高的純度。而且可被降解抗原劑量根據(jù)其種類、免疫次數(shù)、注射途徑及動(dòng)物種類、免疫周期等不同?？乖瓌┝窟^(guò)低或過(guò)高均不能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體在一定范圍內(nèi)，抗體效價(jià)隨注射抗原劑量而增高,二、抗原,抗原溶液最好為中性生理學(xué)緩沖液（如PBS）從丙烯酰胺凝膠中純化抗原：電泳后蛋白定位、制備凝膠碎片（對(duì)于大動(dòng)物）、電洗脫凝膠、轉(zhuǎn)膜（硝酸纖維素膜）后超聲半抗原：交聯(lián)載體（BSA，KLH，藍(lán)載體）多肽抗原：肽長(zhǎng)度、合成難度，肽的

6、活動(dòng)性。最安全的選擇是制備多個(gè)不同區(qū)域的10-15個(gè)氨基酸的合成肽。偶聯(lián)策略,小鼠：首次50-100ug/次；大鼠：100ug-1mg/次，兔0.5-1mg/次加強(qiáng)免疫的劑量為首次劑量的1/5-2/5高度特異性抗血清：策略為低劑量抗原短程免疫法高效價(jià)的抗血清：策略為大劑量抗原長(zhǎng)程免疫法。,三、佐劑的應(yīng)用,顆粒性抗原或全細(xì)胞抗原不需要佐劑可溶性抗原須用佐劑，以增強(qiáng)抗原的免疫原性或改變免疫反應(yīng)的類型，刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答

7、佐劑種類：弗氏（Freund’s）佐劑、脂質(zhì)體佐劑、氫氧化鋁佐劑，SAF-1和RASIFA：羊毛脂1份，石蠟油5份，每毫升IFA中加入1-20mg卡介苗即為CFA。,四、注射途徑,兔：較大體積注射采用多點(diǎn)皮下小鼠：大體積顆粒性抗原通過(guò)腹腔注射、皮下注射（含佐劑可溶性抗原），靜脈注射不適于顆粒性抗原或含佐劑。緩慢釋放抗原：肌肉或皮下注射、皮下注射立即釋放抗原：靜脈注射（常在強(qiáng)化免疫時(shí)用）靜脈注射防止發(fā)生過(guò)敏性休克含佐劑的抗原

8、不可只在一點(diǎn)注射,五、加強(qiáng)免疫,兔：3-6周注射一次，避免每?jī)芍芗訌?qiáng)免疫，持續(xù)使動(dòng)物暴露于免疫原，循環(huán)抗體降低加強(qiáng)免疫效應(yīng)小鼠：2-3周加強(qiáng)免疫一次,用于小鼠的免疫原推薦劑量、免疫方式,,抗原類型 例子 基礎(chǔ)或加強(qiáng)免疫 終加強(qiáng)免疫 途徑 劑量 佐劑

9、 途徑 劑量 佐劑,,,,可溶性蛋白 酶等 ip,sc 5-50ug + iv 5-50ug -顆粒性蛋白 病毒、細(xì)菌 ip,sc 5-50ug + iv 5-50ug -不溶性蛋白 包涵體等 ip,sc 5-50ug + iv 5-5

10、0ug -活細(xì)胞 ip 105-107 - iv 106 -活瘤細(xì)胞 ip 104-106 - iv 106 -碳水化合物

11、 ip 10-50ug iv 10-50ug -,,六、免疫效果評(píng)價(jià),檢測(cè)免疫血清以免疫前血清作為陰性對(duì)照鑒定抗體特異性、效價(jià)、交叉反應(yīng)性。方法：ELISA，Western Blot等,單克隆抗體制備,七、抗體純化,硫酸銨沉淀法：簡(jiǎn)易價(jià)廉、濃度高，但純度不高辛酸沉淀法：純化IgG類抗體，價(jià)廉，但純度不高DEAE柱層析法：起始抗體PH只高于抗體等電點(diǎn)，抗

12、體與DEAE結(jié)合，用離子強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)的緩沖液洗脫。蛋白A、蛋白G柱純化抗體免疫親和層析：從多克隆血清中純化特異性抗體方法,,,免疫親和層析法：（1）用抗原免疫親和柱純化：對(duì)多克隆血清，純化特異性抗體唯一方法（2）用抗Ig免疫親和柱純化抗體：分離大鼠單克隆抗體,八、抗體的保存,血清、組織或培養(yǎng)上清、腹水保存：0.02%NaN3;分裝保存純化抗體保存：PH值調(diào)整，PBS或其他等滲溶液，濃度不宜過(guò)低，如果不用于標(biāo)記可在低濃度抗體中加