根癌農(nóng)桿菌GW4中酶促和H2O2介導(dǎo)的非酶促銻氧化機(jī)制.pdf

1、銻(Antimony, Sb)是劇毒類金屬，與同主族的砷(Arsenic，As)有很多相似的理化性質(zhì)。由于銻的廣泛應(yīng)用、銻礦的開采以及銻化物的大量生產(chǎn)使銻污染問題日益嚴(yán)峻，嚴(yán)重危害人類健康。銻氧化型細(xì)菌可將毒性強(qiáng)的三價(jià)銻類物質(zhì)[Antimonite，Sb(Ⅲ)]氧化為毒性弱的五價(jià)銻[Antimonate，Sb(Ⅴ)]類，降低銻對(duì)細(xì)菌和環(huán)境的毒性。因此，研究細(xì)菌中的銻代謝、鑒定新型銻氧化酶、闡明銻氧化機(jī)制對(duì)環(huán)境銻循環(huán)和銻污染治理均具有重要

2、意義。近年來國際國內(nèi)學(xué)者對(duì)銻轉(zhuǎn)化的研究日漸重視，但在本人碩士研究開始之前(2012年)，微生物Sb(Ⅲ)氧化的分子機(jī)制仍是空白。本研究團(tuán)隊(duì)近年來發(fā)現(xiàn)了多種異養(yǎng)型銻氧化細(xì)菌，本論文以異養(yǎng)型砷/銻氧化菌Agrobacteriumtumefaciens GW4為材料，研究了銻氧化及能量代謝機(jī)制，主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.首次發(fā)現(xiàn)了以NADP+為輔酶的Sb(Ⅲ)氧化酶AnoA。通過前期蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)氧化還原酶AnoA在Sb(Ⅲ

3、)條件下表達(dá)量上調(diào);熒光定量和報(bào)告基因融合的方法證實(shí)anoA基因的轉(zhuǎn)錄受不同濃度Sb(Ⅲ)的誘導(dǎo);基因的同框缺失敲除、互補(bǔ)及超表達(dá)實(shí)驗(yàn)證明anoA與菌株的Sb(Ⅲ)表型密切相關(guān);缺失anoA基因使Sb(Ⅲ)氧化速率（下降～27％）及抗性下降，互補(bǔ)株表型回復(fù)，超表達(dá)anoA使Sb(Ⅲ)氧化速率升高～34％;表達(dá)純化AnoA蛋白進(jìn)行體外酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明AnoA能夠在體外以NADP+為輔酶直接催化Sb(Ⅲ)的氧化，Km為64±10μ

4、M，Vmax為150±7nmolmin-1 mg-1;此外，由于砷、銻結(jié)構(gòu)的相似性，AnoA還能夠在體外催化As(Ⅲ)的氧化，但AnoA與底物As(Ⅲ)的親和力以及酶反應(yīng)速率均不如Sb(Ⅲ);在E.coli中異源表達(dá)AnoA能夠顯著提高菌株Sb(Ⅲ)的氧化速率。以上結(jié)果表明AnoA為細(xì)菌體內(nèi)新型Sb(Ⅲ)氧化酶，但細(xì)菌中仍然存在著其它氧化Sb(Ⅲ)的因子。
　　2.闡明了細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的H2O2能夠作為非酶促因子氧化Sb(Ⅲ)至Sb(

5、Ⅴ)。Sb(Ⅲ)能夠誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生氧化壓力從而產(chǎn)生大量H2O2;能夠?qū)2O2分解為H2O和O2的過氧化氫酶基因katA受不同濃度Sb(Ⅲ)和H2O2的誘導(dǎo)且在菌株對(duì)Sb(Ⅲ)和H2O2的抗性中起重要作用;敲除katA基因后，菌株GW4-ΔkatA的氧化速率顯著加快，且細(xì)胞內(nèi)H2O2含量顯著增加，互補(bǔ)株表型回復(fù);在細(xì)菌體內(nèi)，隨著細(xì)胞的生長，H2O2含量逐漸下降，而Sb(Ⅲ)氧化生成的Sb(Ⅴ)含量逐漸升高(R2=0.93，P＜0.05)，

6、說明細(xì)菌體內(nèi)逐漸減少的H2O2用于氧化Sb(Ⅲ);在培養(yǎng)基中，Sb(Ⅲ)過量的條件下，添加的H2O2濃度越高，Sb(Ⅲ)氧化生成的Sb(Ⅴ)含量越多，呈正相關(guān)(R2=0.94，P＜0.05)。以上結(jié)果表明Sb(Ⅲ)誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化壓力與菌株對(duì)Sb(Ⅲ)氧化及抗性密切相關(guān)，胞內(nèi)H2O2作為非酶促因子氧化Sb(Ⅲ)能夠同時(shí)降低Sb(Ⅲ)和氧化壓力對(duì)細(xì)胞的毒害，是細(xì)菌中一種重要的“以毒攻毒”的機(jī)制。
　　3.鑒定了砷氧化酶AioAB在菌株

7、GW4的Sb(Ⅲ)氧化過程中的作用。砷氧化酶AioAB能夠在細(xì)胞周質(zhì)氧化As(Ⅲ)為As(Ⅴ)。前期研究表明AioAB在A.tumefaciens5A中也能夠催化Sb(Ⅲ)的氧化，aioA基因的缺失使菌株5A的Sb(Ⅲ)氧化速率下降。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在A.tumefaciens GW4中敲除aioA基因后菌株GW4的氧化速率加快;熒光定量PCR結(jié)果表明這是由于aioA基因的缺失能使銻氧化酶基因anoA和過氧化氫酶基因katA上調(diào)表達(dá);

8、此外，加銻條件下突變株GW4-ΔaioA細(xì)胞內(nèi)H2O2含量也比野生型明顯增加，互補(bǔ)株的表型回復(fù)，說明缺失aioA后細(xì)胞內(nèi)AnoA催化的酶促和H2O2介導(dǎo)的Sb(Ⅲ)氧化均會(huì)上調(diào)。以上結(jié)果表明AioAB在菌株GW4中作用并不顯著，但通過影響AnoA和KatA的表達(dá)來參與銻氧化。
　　4.闡明了菌株GW4中Sb(Ⅲ)和砷氧化酶AioAB對(duì)銻響應(yīng)代謝途徑和能量產(chǎn)生的影響。通過前期蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)合基因的轉(zhuǎn)錄和代謝通路分析，發(fā)現(xiàn)Sb(Ⅲ)

9、能夠誘導(dǎo)菌株GW4和突變株GW4-ΔaioA中Sb(Ⅲ)氧化和抗性、壓力響應(yīng)、碳代謝、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性、磷酸鹽和磷酸酯代謝、核苷酸和氨基酸代謝等相關(guān)蛋白/基因的表達(dá);且在加Sb(Ⅲ)條件下，菌株GW4-ΔaioA中這些代謝路徑蛋白/基因上調(diào)更顯著。因此我們認(rèn)為這是由于細(xì)胞周質(zhì)Sb(Ⅲ)氧化消失后，Sb(Ⅲ)對(duì)細(xì)胞造成了更多的毒害作用，因此細(xì)胞質(zhì)中AnoA和氧化壓力相關(guān)的蛋白均上調(diào)，加快細(xì)胞內(nèi)Sb(Ⅲ)的氧化;同時(shí)，TCA循環(huán)上調(diào)從而產(chǎn)生更多的

10、能量供菌株生長并抵御Sb(Ⅲ)的毒性;Sb(Ⅲ)氧化過程中產(chǎn)生的能量用于Sb轉(zhuǎn)運(yùn)、DNA損傷修復(fù)、蛋白質(zhì)的合成、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等。
　　綜上，本論文通過對(duì)異養(yǎng)型Sb(Ⅲ)氧化菌GW4的系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)了新型銻氧化酶，首次提出了細(xì)菌的Sb(Ⅲ)氧化是一個(gè)由酶促反應(yīng)(AnoA，AioAB)和非酶促反應(yīng)(H2O2)共同組成的共代謝過程。此外，還闡明了砷氧化酶AioAB對(duì)Sb(Ⅲ)壓力響應(yīng)代謝路徑和能量產(chǎn)生的影響，解析了菌株GW4在加Sb(Ⅲ)條