細胞微生物學研究方法

1、細胞微生物學研究方法,前言,人們僅確知一小部分細菌可導致人類疾病。這些細菌一般可分為兩類：致病菌和條件致病菌。醫(yī)療手段不斷提高，抗生素的研制也在不斷發(fā)展，但由各種病原體所導致的疾病仍有很高的發(fā)病率和致死率 。越來越多耐藥性病原體的出現可能使我們很快進入一個“后抗生素期” 。更好地理解病原體的毒力機制和疾病中病原—宿主相互作用可為治療疾病確立新的靶。我們應該發(fā)展更多的新的分子生物學技術來研究細菌的各個組分，確定細菌的毒力因子。,Ko

2、ch’s Postulates,1890年, Koch: 要想確定一種疾病是由于某種微生物的感染所引起，必須滿足4項條件：一、每一例病人體內都可以分離到該病菌。二、該病菌可以在體外培養(yǎng)數代。三、培養(yǎng)了數代的細菌可以使實驗動物引發(fā)同樣的疾病。四、被接種的動物中可以分離到同樣的病菌。,Molecular Koch‘s postulates,基因可以在有確定毒力表型的菌株中發(fā)現；基因突變后表型喪失；再導入該基因將在突變株中重建該表

3、型。,Stanley Falkow. Molecular Koch‘s postulates applied to microbial pathogenicity. Rev Infect Dis. 1988. 10 S2:S274-6,常用的體外微生物實驗技術常用的體內微生物實驗技術,DNA 突變重組差異表達研究技術Microarray 基因芯片,常用的體外微生物實驗技術,突變分析,突變(Mutation)：細菌的基因結構發(fā)生偶然

4、的改變。 細菌的自然突變率與其生物的自然突變相同，每106～108次細胞分裂發(fā)生一次。細菌每20～30分鐘分裂一代，故突變株相對較多。 細菌中點突變較多見。當突變發(fā)生在DNA一對或少數幾對堿基引起改變時，稱為點突變。,突變分析,1. 定向突變 （directed mutation） 是用于評價特異細菌基因產物毒力分布的最廣泛技術。在一種稱為“反向遺傳學”的技術中，編碼假定毒力因子的基因被插入滅活或基因替代所破壞，然

5、后比較同源突變株與親代株的毒力。這一技術需要將DNA介導入病原體內，還需要合適的選擇性標記以及同源重組的天然能力。,在定向突變中，抗生素耐受標記或其他選擇性標記連于靶基因克隆復制物的編碼序列內，這就破壞了基因的正常轉錄和翻譯，并為選擇重組子提供了標記。接著，重組子被介導入靶病原體，并與細菌染色體的同源區(qū)進行重組。如果耐受標記兩側是染色體特異序列，就會發(fā)生雙重交叉（double crossover），標記基因整合入染色體序列，而載體序列不

6、整合 。,定向突變,蔗糖敏感標記在H.pylori vacA基因中導入突變的方法,PCR：H.pylori flaA啟動子區(qū)、無啟動子的sacB基因， 卡那霉素耐受基因（kan）,構建kan-sacB cassette,插入pEK，得到pEnKSF,1.95kb的vacA基因（EcoRⅠ-KpnⅠ）克隆入pBluescript KS載體，構建pEK,與細菌染色體的同源區(qū)進行雙交換重組,突變的VacA菌株,定向突變,隨機突變,傳統(tǒng)的方法使

7、用UV或化學試劑在細菌基因組內造成核苷酸的改變，導致基因表達的變化 。缺點：沒有合適的方法來篩選減毒株和突變的基因細菌轉座子(transposon)轉座子是存在于染色體DNA上可自主復制和位移的基本單位，常通過產生插入突變影響基因的調控與表達，導致細菌生物學性狀或毒力等的改變。轉座子誘變技術已被廣泛用于細菌分子遺傳學研究，包括3個步驟：將轉座子插入靶基因；篩選感興趣的突變體，并證實該突變是由轉座子插入引起的；確定并克隆靶基因。

8、 優(yōu)點：不需要鑒定待測基因的產物，只要轉座基因插入可引起表型發(fā)生變化的基因均可用此法分離鑒定。,二、差異表達研究,分離微生物差異表達基因mRNA 差異顯示技術差減雜交和抑制差減雜交cDNA代表性差異分析基因鑒定集成法,二、差異表達研究,1. mRNA 差異顯示技術DD-PCR mRNA differential display reverse transcription PCR 是建立在基因差別表達的基礎上，

9、通過比較不同的個體之間mRNA的差異，應用反轉錄PCR技術而發(fā)展起來的一種分離未知基因的方法。 缺點：重復性差、假陽性高、差異片段短小等。,2、差減雜交和抑制差減雜交,差減雜交(subtractive hybridization，SH） Straus等于1990年首次用于微生物研究：野生株酵母與變異株酵母進行消減雜交。抑制差減雜交 （suppression subtractive hybridization, SS

10、H） 1996年Diatchenko在SH基礎上進一步改善。,差減雜交的原理：,提取待比較的兩種基因組DNA,待于尋找差異DNA的稱為實驗株（tester）,,另一方作參考，稱為驅動株（driver）,,,在雜交前連接接頭和tester DNA，并用生物素標記driver DNA 。,保證tester DNA序列較短,雜交,雜交后，含有driver DNA的雜合子可通過鏈親和素的吸附作用而移去,接頭序列為引物，用PCR擴增剩余的

11、序列，也就是僅存在于tester DNA中的序列,重復一次,將PCR序列克隆入載體中，產生差減文庫,抑制差減雜交技術（SSH）,將tester DNA分為兩部分，各自在5’端接上不同的接頭,,driver DNA雜交的序列應均被清除，只留下tester 特異的單鏈序列,用與接頭序列結合的引物進行PCR擴增 * 抑制效應：兩端含有相同接頭的序列由于形成二級結構阻止了引物的退火，只有兩端含有不同接頭的e分子得以擴增。,單鏈 teste

12、r DNA,雙鏈tester DNA,tester DNA和driver DNA形成的異源雙鏈分子,driver DNA單鏈及自身退火的雙鏈分子,第二輪雜交。將兩份雜交產物混合并進行第二次雜交，產生第5種新的雙鏈分子e，它的兩個5’端連有兩個不同的接頭，兩條鏈均為tester DNA特異鏈,將PCR序列克隆入載體中，產生差減文庫,SH在微生物研究中的應用,檢測毒力島，尋找毒力有關基因。檢測不同菌株表達的不同；同一株菌在不同條件下表達的

13、不同。 檢測有毒株與無毒株的基因差異，研究毒力的改變如黏附性、侵襲性。2000年用SH方法檢測有毒株TB和無毒株TB表達的不同，或高表達的基因。發(fā)現了devR和devS與毒力有關。 B組鏈球菌主要分為III-1,2,3株，其中III-3最易感染新生兒，說明毒力最強，用SH將它與III－2、1進行雜交，發(fā)現9個短特異序列，可能與毒力有關。,SH技術的缺陷,表達量很低的差異mRNA也很難被擴增。所以一些量

14、少的基因不作為SH的檢測對象，如轉錄因子，細胞因子，受體等。要檢測出表達量的不同要高于5倍才行。一些重要的差異基因可能會漏過。SH主要檢測在G+C％豐富的菌中G+C％含量低的區(qū)域。SH無法將兩個菌的不同基因都測出，得到的產物不全是差異基因。要考慮用其他技術補充。,3、cDNA代表性差異分析 cDNA RDAcDNA Representation difference analysis,綜合了差減雜交和差別顯示兩項技術的優(yōu)點，

15、并充分利用PCR反應的特性，達到特異性擴增目的基因的目的。 原理：每次對兩個cDNA 代表群進行差減雜交前都更換特定的接頭和引物,利用PCR以指數形式擴增雙鏈模板（帶有特定接頭的tester DNA），而僅以線性形式擴增單鏈模板這一特性，從而使得只有差異表達的基因片段得到高度富集。,cDNA RDA,4、基因鑒定集成法( IPGI) cDNA Representation difference analysis,是對以往各種相

16、關技術的一種有效的綜合。在目前表達序列標簽( Expressed Sequence Tags , ESTs) 計劃發(fā)展的基礎上，總結了現有的各種基因差別表達分析技術的優(yōu)缺點，將 DD-PCR、SSH、SAGE和基因數據庫技術進行了有機結合。 特點：tester有兩種不同的接頭，在差減雜交中只有代表稀有拷貝基因且兩端帶不同接頭的cDNA 片段才能以指數擴增，使得目的序列得以高度富集；只回收3’ cDNA，從而最大限度地利用ESTs

17、數據庫。,三、基因芯片,基因芯片是指通過微加工技術將大量的DNA以預先設計的排列方式有序地固定在載體表面，形成儲存有大量信息的DNA陣列。檢測時，首先用不同條件下培養(yǎng)的細菌的RNA為模板，以放射性同位素或熒光標記的dNTP為底物反轉錄合成cDNA。再用所得cDNA與DNA芯片進行雜交，然后通過計算機對結果進行判讀和處理，這樣就可以找到條件變化時基因表達的情況。,基因芯片應用,微生物比較基因組學研究微生物基因表達譜研究微生物檢測鑒定研

18、究,Microarray 特點,規(guī)模化檢測PCR基礎的microarray 不能檢測到點突變和嵌合基因存在一定假陽性率和假陰性率，需用其他方式驗證,,問號鉤體基因組DNA芯片的組成,鉤體賴株在GenBank中共注釋了4727個基因，鉤體DNA芯片上共包含了3528個ORFs，每個ORF在芯片上有三個重復。每張芯片還包含了相應的陽性對照點（鉤端螺旋體代謝相關基因）及陰性對照點（棉花和人的基因）。,STMIVETDFIIVE

19、ATGAMBIT,常用的體內微生物實驗技術,體內誘導基因 in vivo-induced gen，ivi gene,僅在微生物進入宿主體內后才被誘導表達在體外生長時不表達的獨特基因。往往能增強其在宿主體內的生存能力，致病性甚至決定著細菌毒力強弱，極有可能是病原菌在宿主體內生長、繁殖及致病的關鍵基因，也是潛在的抗生素作用靶點、診斷抗原以及疫苗候選者，具有重要的研究價值。隨著分子生物學技術及分子遺傳學研究手段的發(fā)展，依賴動物模型

20、的IVET、DFI、STM 以及不依賴感染動物模型的IVIAT 等研究方法的發(fā)明及成功運用使得針對微生物 ivi gene 的研究成為可能。,是一種基于轉座子的突變技術。是由Holden 及其同事于1995 年在研究傷寒鼠沙門氏菌時建立起來的，用來鑒定能使病原體在宿主體內成功存活和繁殖的決定性基因。在病原體的基因組中隨機插入特異性信號標簽，與病原體致病有關的毒力基因中由于插入轉座子而失活，無法在宿主體內生存、繁殖。通過突變體庫感染宿

21、主，然后對未存活的突變體進行負篩選就可篩選出毒力基因失活的突變體菌株。,信號標簽誘變（STM） Signature-tagged mutagenesis,STM技術tags的構建：可變區(qū)40bp，由4個堿基隨機排列而成，理論上可形成1012種不同DNA片段。,,STM 的特點,通過聯合轉座子插入誘變技術和體內負篩選原則使篩選策略由原來針對單個突變株的逐一鑒定轉變?yōu)獒槍碗s突變體群的系統(tǒng)篩選，篩選過程更為快捷與系統(tǒng)；特異性DNA 序列

22、對突變體的逐一標記也能輕易地鑒定出被突變的基因，將工作量和實驗動物用量降到最低。,STM 的局限性,一是插入性誘變實驗存在的共同局限性，如插入事件存在隨機性，使得某些較小基因片段(<400 bps)的插入性轉座誘變較難實現；某些基因區(qū)域本身為體內轉座或重組的熱區(qū)或冷區(qū)也影響著轉座誘變作用的成功率；需要建立能方便地從其感染器官組織中回收尚且存活的細菌突變株的合適動物模型等。 另一方面的局限性則為STM 技術所特有，包括：標簽信號衰

23、減的影響；眾多突變體株同時收集并實驗可能導致其中某些單一信號的削弱，從而影響結果可靠性；另外，由于多個突變株同時存在并共同作用，突變株之間的缺陷代償可能導致某些突變基因不能被篩選與鑒定，出現假陰性結果等。,體內表達技術In vivo expression technology，IVET,利用病原基因組隨機片段與缺乏啟動子的報告基因構建融合載體（啟動子誘捕文庫），在動物體內重組到細菌基因組中而使報告基因表達，篩選病原菌感染過程中表達基因

24、的方法。 采用常規(guī)的分子生物學技術即能進行篩選，不需要昂貴的儀器設備，優(yōu)勢明顯；不需要對目標病原菌的基因組特性進行深入詳細的認識即可對細菌在宿主環(huán)境條件下的基因表達情況進行分析研究。,Example: 鼠傷寒沙門菌purA缺陷型模型purA基因作為可選擇的報告基因；lacZ基因（編碼β-半乳糖苷酶）供體外選擇。,差異熒光誘導（DFI）,以GFP為報告基因來監(jiān)測啟動子活性。 將GFP 編碼基因置于目標病原菌啟動子文

25、庫的下游，采用熒光激活細胞分選術對包含有啟動子-GFP融合活性的菌落與不能表達GFP 的菌落進行分離，通過對體內及體外環(huán)境中熒光細胞的連續(xù)分離與比較以確定僅在體內環(huán)境中存在的細胞及相應的突變基因。,gfp基因 編碼一種水母蛋白-綠色熒光蛋白（GFP），在受到藍光激發(fā)后會發(fā)出綠色熒光。GFP的一個重要特征是它的熒光信號能通過FACS來檢測，這意味著含有與gfp基因融合的啟動子庫的細菌可自動篩選出活化的啟動子，這樣成千上萬的啟動

26、子可在數分鐘內被分離。FACS還能分選表達GFP的細菌粘附或內在化的真核細胞，使檢測由于和宿主細胞相互作用而激活的細菌基因成為可能。,將熒光激活細胞分選術和基因組學研究進行整合，對微生物基因表達情況進行高通量的半自動篩選，操作簡單、迅速、實驗重復性高；具有熒光性質穩(wěn)定，無細胞毒性，不干擾細菌在宿主體內的侵襲、擴散和增值過程，可直接用于活細胞測定等優(yōu)點。GFP 的運用使研究者能對基因的表達情況及單細胞水平的啟動子活性進行客觀觀察與分析

27、，并可通過簡單改變熒光閾值來調節(jié)選擇敏感性。,DFI的特性,不能檢測需要轉錄后調節(jié)的基因；需要構建和分析目標基因突變株以評估靶基因在天然感染中的作用；細菌的聚集與粘附可能影響流式細胞分類與檢測分析；研究環(huán)境的pH 變化、氧氣供給情況以及缺乏信號放大效應等也會影響GFP 的使用；由于熒光為非線性信號，每次實驗時都需要對信號的線性范圍進行檢測和校準以確保準確量化基因的表達情況；采用細胞模型，不適用于動物模型的篩選，因此篩選結果不夠

28、全面，不能反映致病菌感染的全部環(huán)節(jié)。,DFI的缺陷,體內誘導抗原技術 IVIAT （in vivo induced antigen technology）,直接從“蛋白”角度入手篩選毒力基因 Handfield及其合作者于2000年在研究口腔病原菌時設計提出，通過對表達文庫進行免疫篩選得到病原菌的體內誘生基因。 作為一種簡單有效的篩選技術，IVIAT 已被成功用于多種病原微生物ivi gene 的研究中，如豬鏈球菌、炭疽桿菌、傷

29、寒沙門氏菌以及白色念珠菌等等。,體內誘導的抗原技術,取感染過所研究病原體的多個病人的血清，用體外生長的該病原細胞將相應抗體全部吸收，只留下僅在體內表達的抗原的相應抗體。,在合適的宿主中建立該抗原DNA的表達庫,用吸收后血清探測這些克隆,有反應的克隆即產生自然感染而非體外培養(yǎng)過程中表達的抗原，通過純化、測序，即可鑒定體內誘導的抗原基因。,將這些抗原純化，用于證實IVI抗原確由病原體在感染過程中表達。,IVIAT的特點,IVIAT不依賴于動

30、物模型，而是以急性感染患者的恢復期血清為探針篩選病原菌的 ivi gene，應用范圍廣泛，可真實全面地反映病原菌與人類感染宿主之間的相互作用。 僅使用簡單的免疫學和常規(guī)基因組克隆技術即可快速及時對病原菌基因組進行系統(tǒng)篩選，不需要對目的病原菌基本遺傳學背景進行詳細了解，尤其適用于一些新現病原菌的致病性研究。 所需生物學材料極少，僅需采集受染患者的恢復期血清或少量含有病原菌的受染組織或體液成分即可進行，血清庫的建立使研究人員可以最大程度

31、獲得病原菌不同途徑感染和感染不同階段的抗原。,IVIAT的缺陷,僅適用于可培養(yǎng)病原微生物；具抗體反應依賴性；對于一些不具免疫原性或某些細菌在體內體外生存都必需的毒力基因表達產物不能很好鑒別；不能自動化操作；會受到免疫交叉反應的影響而造成假陽性，因此IVIAT 的陽性菌落需要經過多次重復篩選，還需用陰性感染血清為對照以確保免疫反應的特異性。,4種細菌毒力基因篩選技術方法的比較,體外轉座進行基因組分析和作圖 GAMBIT Ge

32、nomic Analysis and Mapping by In Vitro Transposition,鑒定基因組已經被測序的微生物中對于病原菌的生長(體內/體外)是必需的基本基因。,a. Strategy for producing chromosomal mutations by using in vitro transposon mutagenesis.,A specific region of the ch

33、romosome is amplified by extended- length PCR, and subjected to in vitro transposon mutagenesis. The resultant pool of mutagenized DNA is then transformed into bacteria, which are then grown under selective conditions

34、(e.g. on defined medium or in an animal). PCR is then performed on the post selection pool using a transposon-specific primer and a primer to a known location on the chromosome. Subsequent analysis of the PCR products

35、allows determination of which genes in that region of the chromosome are required for survival under those selective conditions.,b. Genetic footprinting for detection of essential genes.,GAMBIT提供了一種有力的手段在那些比體外豐富培養(yǎng)基環(huán)境要嚴格得

36、多的環(huán)境下鑒定病原生長或生存的必須基因，目前已經被成功運用于鑒定流感嗜血桿菌、釀酒酵母、肺炎鏈球菌等病原的基本基因。 GAMBIT雖然是應用在基因組水平的分析，它仍然可以針對某段感興趣的特別的特定DNA元件或染色體區(qū)域進行操作，例如噬菌體和毒力島等。,GAMBIT的特點,噬菌體展示技術 (phage display techniques,PDT）,噬菌體（Bacteriophage）：是感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的

37、總稱，部分能引起宿主菌的裂解，具有基因和結構單一性的特點。PDT是一種將外源肽或蛋白質與特定噬菌體衣殼蛋白融合并展示于噬菌體表面的技術。它將外源基因插入到噬菌體展示載體的信號肽基因和衣殼蛋白編碼基因之間，從而使外源基因編碼的多肽或蛋白質與外殼蛋白以融合蛋白質形式展示在噬菌體表面，被展示的外源肽或蛋白質可保持相對獨立的空間結構和生物活性，以利于靶分子的識別和結合。 探測蛋白空間結構、探索受體與配體之間相互作用結合位點、確定抗原表位、尋

38、找高親和力和生物活性的配體分子。,PDT原理,主要包括三方面內容：通過 DNA 重組的方法插入外源基因，形成的融合蛋白表達在噬菌體顆粒的表面，同時保持外源蛋白的天然構象，不影響噬菌體的生活周期，也能被相應的抗體或受體所識別；篩選目的噬菌體，利用固定于固相支持物的靶分子，采用適當的淘洗方法，洗去非特異結合的噬菌體，篩選出融合噬菌體；外源多肽或蛋白質表達在噬菌體的表面，而其編碼基因作為病毒基因組中的一部分可通過分泌型噬菌體的單鏈 DN

39、A測序推導出來。,PDT,PDT局限性,在噬菌體展示過程中必須經過細菌轉化、噬菌體包裝，有的展示系統(tǒng)還要經過跨膜分泌過程，大大限制了所建庫的容量和分子多樣性。不是所有的序列都能在噬菌體中獲得很好的表達，因為有些蛋白質功能的實現需要折疊、轉運、膜插入和絡合，導致在體內篩選時需外加選擇壓力。噬菌體展示文庫一旦建成，很難再進行有效的體外突變和重組，進而限制了文庫中分子遺傳的多樣性。由于噬菌體展示系統(tǒng)依賴于細胞內基因的表達，所以，一些對細