腫瘤研究方法

1、Approaches and Techniques in Research on TumorA course for Ph.D. candidates,腫瘤的實驗動物和細胞研究技術,The animal model and in vitro research of tumor,常用研究方式：In Vitro: 體外研究，細胞、組織培養(yǎng)下進行In Vivo: 體內(nèi)研究，人類疾病的動物模型Ex Vivo: 細

2、胞經(jīng)體外實驗處理后，再回輸?shù)襟w內(nèi) 體外處理：轉(zhuǎn)染基因或改變環(huán)境(用一些因子) 使其分化等,體外研究(In Vitro ) 原代培養(yǎng)腫瘤細胞: 從腫瘤組織中分離得到的細胞在體外成功地進行 培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)(primary culture)腫瘤細胞系:原代培養(yǎng)腫

3、瘤細胞能連續(xù)傳代（約7～10天傳代一次） 半年以上,生長穩(wěn)定, 并能保持腫瘤細胞的特性， 稱為腫瘤細胞系(cell line)腫瘤細胞株:細胞系經(jīng)細胞克隆或其它方法獲得具有某種生物學特性 的純譜系的細胞稱為腫瘤細胞株(cell strain), 細胞具有 相同的

4、基因型和表型(單克隆),腫瘤細胞株的建立： 1、 直接從人的腫瘤或動物的自發(fā)及誘發(fā)腫瘤組織分離培養(yǎng) 建系和建株; (從自發(fā)或誘發(fā)瘤) 2、從人或動物的移植腫瘤(如人腫瘤裸鼠移植瘤)組織分離 培養(yǎng)建系及建株; (從移植瘤) 3、用化學或生物(病毒)方法在體外轉(zhuǎn)化正常的人或動物的 細胞株而獲得腫瘤細胞株。(體外轉(zhuǎn)化),,腫瘤

5、細胞株的鑒定： 1. 有關的原始資料,包括供瘤病人的姓名、年齡、性別、病歷號、 臨床診斷（TNM）、活檢病理診斷,手術切除日期、最后病理診斷等   2.形態(tài)學觀察: ▲普通倒置相差光鏡:活細胞的形態(tài), 細胞間橋,分泌顆粒,重疊生長, ▲Giemsa染色或H.E.染色的光鏡 形態(tài)與腫瘤細胞的生長條件有一定關系:

6、 HeLa: 高濃度血清→長梭形; 低濃度血清→圓形細胞,排列如鵝卵石路面; ▲透射和掃描電鏡 ▲3D組織結(jié)構,3.  核型及染色體觀察: 整倍體,異倍體,染色體畸變、標記染色體,染色體分帶分析, 相隔一定時間重復觀察數(shù)次

7、 4.生長特性: 分裂指數(shù)（[3H]-thymidine或5-BrdU的labeling index）、 生長曲線、 細胞群體倍增時間、 集落形成或貼壁率（plating efficiency） 半固體培養(yǎng)介質(zhì)中的集落形成率 5.組織特性的鑒定: 免疫細胞化學方法,上皮性腫瘤標志:

8、 CK、上皮膜抗原（EMA）、 癌胚抗原（CEA）; 淋巴瘤抗原標志: 人白細胞分化抗原簇（CD）,有274個以上, T淋巴細胞: UCHL-1(CD45RO), B淋巴細胞: L26（CD20）, 軟組織腫瘤標志：波形蛋白（Vm）

9、 肌源性：結(jié)蛋白（Dm）、肌動蛋白、肌凝蛋白、肌紅蛋白 神經(jīng)源性： 神經(jīng)微絲（NF）、S-100蛋白、 Leu-7、 神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、髓磷脂堿性蛋白(MBP) 組織細胞源性： α-1抗胰蛋白酶、 α-1抗糜蛋白酶、CD68 血管源性：八因子相關抗原、CD34、荊豆凝集素(UL) 基膜源性：纖連

10、蛋白（FN）和層粘連蛋白（LN）體外培養(yǎng)時腫瘤細胞株有可能會失去原本表達的某些組織抗原,抗原標志要多選用幾種抗體,以減少假陰性結(jié)果;,6. 其他特性： (a) 分泌激素和異位激素: 絨毛膜癌→HCG 垂體瘤→生長激素 肺燕麥細胞癌和一些甲狀腺癌→ACTH 人肺巨細胞癌細胞株（PLA-801）→促性腺激素

11、 肝癌→HCG (b)    腫瘤細胞的受體表達: ER PR AR (c)    酶及同工酶活性: 酶活性保持(HTC→酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、變化 誘導劑 糖皮質(zhì)激素、多肽激素

12、 改變培養(yǎng)條件：谷氨酸替代谷氨酰胺→腦星形膠質(zhì)細胞谷氨酰合成酶 活性增7倍左右 特異的同工酶譜： 絨癌T3M-3表達胎盤性堿性磷酸酶,(d)    癌基因及抑癌基因核酸及蛋白的表達： 高轉(zhuǎn)移人卵巢細胞系H

13、O-8910PM 表達：p53 p16 bcl-2 nm-23 CD44v6 c-erbB-2 EGFR 等基因的蛋白產(chǎn)物 不表達：Bax基因的蛋白產(chǎn)物,7. 細胞株交叉污染的檢測： 細胞遺傳學方法： 染色體分析

14、 特異的染色體標志探針作FISH G帶核型分析鑒別同種腫瘤細胞 Q帶分析檢測人Y染色體  免疫學方法：HLA或動物的組織相容性抗原的測定  生化方法：同工酶譜或其它生化指標,8. 微生物污染的檢測： 細菌：培液混濁，高倍鏡下隱約可見均勻散在細小菌體 真菌

15、：培液混濁，高倍鏡下可見菌絲或孢子 病毒：病毒核酸和蛋白產(chǎn)物 支原體：以核酸（DNA）熒光染色即H-stain(Hoechst 33258， 即二苯并咪唑染色)較為常用, 356nm光的激發(fā)下 可發(fā)出458nm的強熒光,,體外正常細胞惡性轉(zhuǎn)化的鑒定 正常細胞體外惡性轉(zhuǎn)化的鑒定指標(14項指

16、標) （第二屆全國細胞和組織培養(yǎng)專題討論會通過）  ▲核型分析出現(xiàn)非整倍體 ▲能在軟瓊脂培養(yǎng)基中增殖并形成集落 ▲異種動物接種能生成腫瘤 ▲端粒保持不變或延長以及端粒酶活性的增高,,指標

17、正常細胞 轉(zhuǎn)化的纖維母細胞 轉(zhuǎn)化的上皮細胞 形態(tài) 伸展良好,折光較弱;核質(zhì)比小, 梭形,伸展較差,折光較強;核質(zhì)比大, 與正常細胞之間差別不如纖維母細胞 胞質(zhì)嗜堿

18、性弱;核仁較小較少; 胞質(zhì)嗜堿性強,核仁較大較多;多核巨細胞 大;多形性較常見 多核巨細胞較少 較多  粘附性

19、 細胞間粘附性較強,緊貼瓶壁生長 粘附性差,易脫落 差別不明顯生長特性 排列有方向性,單層生長,存在密度 方向性消失,多層重疊,密度依賴性抑制消失 差別不明顯,某些細胞株呈重疊生長 依賴性抑制  對血清的依賴 較高

20、 較低 差別不明顯 掃描電鏡觀察 微絨毛少 微絨毛豐富

21、 微絨毛不穩(wěn)定,有時增多 植物凝集素引起的凝集 弱 較弱 較強 細胞表面的糖蛋白和糖脂 正常

22、 糖基化不完全 糖基化不完全 纖維連接蛋白 正常存在 減少或消失 纖溶酶原激活酶 較低

23、 增高 不穩(wěn)定,某些株增高 胞質(zhì)中微絲微管的排列 規(guī)則 紊亂

24、 不穩(wěn)定 胞質(zhì)cAMP濃度 較高 較低  核型 二倍體

25、 非整倍體或假二倍體 非整倍體 瓊脂培養(yǎng) 不生長 生長

26、 生長 接種異種易感動物 不長腫瘤 長腫瘤 長腫瘤,,,,世界各國的細胞庫（cell bank）及索引  美國 美國典型培養(yǎng)細胞庫（Am

27、erican Type Culture Collection, 即ATCC, Rockville,MD） 人與動物細胞培養(yǎng)目錄（Catalog of Human and OtherAnimal Cell Cultures, Naval Biosciences Laboratory, Cell Culture Department, N

28、aval Supply Center, Oakland,CA) 人基因突變細胞及老年細胞培養(yǎng)庫（Human Genetic Mutant Cell Culture and Ageing Cell, Culture Repositories, Institute for Medical Research, Camden, NJ)

29、 歐洲 真核細胞培養(yǎng)庫(Culture de Cellules Eucaryotes, Repertoire des Utilisateurs., M. Adophe, D. Gourdji, A.Tixier-Vidal, R. Robineaux, Inserm Publications,101 Rue de Tobiac,7

30、5654 Paris, Cedex 13 醫(yī)學病毒學系（Department of Medical Virology,Institute de Pasteur, Paris) 歐洲動物細胞培養(yǎng)庫（European Collection for Animal Cell Cultures,即ECACC, PHLS/CAMR,

31、 Porton, Salisbury, England) 歐洲人類基因突變細胞庫(European Human GeneticMutant Cell Bank, Department of Clinical Genetics, Erasmus University, Ro

32、tterdam) 日本 癌細胞系庫(Collection of Cancer Cell lines, National Institute of Hygenic Sciences, Tokyo) 普通細胞庫( General Cell Bank, Institute of Physical and Chemical Research of RIKEN, Sai

33、tama)  Flow Laboratories; GIBCO,,,特殊表型腫瘤細胞系（株）： 高轉(zhuǎn)移 人肝細胞性肝癌細胞株MHCC97 人黑色素瘤細胞株MV3、 卵巢癌細胞株HO-8910PM、 肺巨細胞癌細胞株

34、PGBE1 高度耐藥 人紅白血病細胞株K562/ADM對阿霉素的抗性增114.7倍 分泌產(chǎn)生激素、蛋白、酶或一些因子 人肺小細胞癌細胞株LU-165→抗利尿激素; 人肺腺癌細胞株LC-2/ad→α1-抗胰蛋白酶 人紅白血病細胞株K562高表達端粒酶,體內(nèi)研究(I

35、n Vivo) 腫瘤動物模型： 自發(fā)性腫瘤 誘發(fā)性腫瘤 移植性腫瘤.,一、自發(fā)性腫瘤 種系：大鼠的自發(fā)腫瘤不如小鼠多見，大動物更為少見

36、Sinclair豬到一歲時有85%可發(fā)生惡性黑色素瘤 品系： C3H小鼠 ― 乳腺癌發(fā)病率為97% BALB/c ― 乳腺癌發(fā)病率低 AKR小鼠 ―淋巴細胞性白血病發(fā)病率為70%~90% 近交系SJL/J小鼠 ―淋巴瘤(何杰金病)自發(fā)率高達91% 缺點：發(fā)病遲,發(fā)病時期不集中,發(fā)病率也不穩(wěn)定,二、誘發(fā)性

37、腫瘤 優(yōu)點：發(fā)生率、發(fā)病時間、發(fā)生部位及組織學類型均易控制 實驗結(jié)果重復性相對較好 1.化學誘癌動物腫瘤模型 1775年英國醫(yī)師Pott 掃煙囪 陰囊癌 1914年,日本學者山極和市川 煤焦油 皮膚癌 1934年Yashida用鄰氨基偶氮甲苯誘發(fā)大鼠肝癌成功 我國從1960年代開始進行化學誘癌動物模型

38、的研究 1956年亞硝胺和1961年黃曲霉毒素的致癌作用相繼被發(fā)現(xiàn),(1) 化學致癌物 ▲ 誘發(fā)時間相對較短 ▲有劑量-效應關系 ▲基因毒化學致癌物一般具有高度親電子性， 與生物大分子中富于電子的親核殘基相結(jié)合, 影響鹼基對的正常配位或大分子的結(jié)構與功能 →正常細胞的癌變. ▲直接致癌物和前致癌物（間接致癌

39、物）,常見化學致癌物: 1) 多環(huán)碳氫化合物: 25種以上, 以煤焦油的主要成分3,4-苯并芘 和3-甲基膽蒽的致癌性最強 2) 氨基偶氮化合物: 二甲基氨基偶氮苯亦稱二甲基黃(奶油黃),

40、 3’-甲基-4,4’-二甲基氨基偶氮苯(3’-Me-DAB)      3)芳香胺類: 苯胺印染工廠 吸入乙萘胺在肝變?yōu)榘被浇?jīng)腎排出 聯(lián)苯胺→膀胱癌

41、 2-乙酰氨基芴(2-AAF)     4)亞硝胺類: 亞硝酸鹽+二級胺→亞硝胺類化合物 強致癌物 致癌譜甚廣 不同分子的亞硝胺化合物仍有一定的器官親和性

42、 對稱衍生物如二烷基亞硝胺→肝癌 不對稱的亞硝胺→食管癌,5)霉菌毒素: 種類較多 首推黃曲霉毒素(aflatoxin),存在于霉變的花生、 玉米及谷物中,     6)金屬元素 :

43、 砷、鉻、鎳、→肺癌 鎘→前列腺癌. (2)影響化學致癌的因素,1)      動物方面品系: 誘發(fā)肝癌時：F-344大鼠對DEN和2-AAF的敏感性要比其它品系的大鼠高 誘發(fā)皮膚腫瘤：BALB/c和SENCAR品系小鼠對DMNU、DENU的敏感性

44、 大大高于Swiss品系小鼠性別: 2AAF誘發(fā)肝癌：♂小鼠60%發(fā)生肝癌,♀小鼠不敏感. F-344大鼠,♀比♂更敏感年齡: 一般而言,動物年齡越小,對化學致癌物越敏感, 敏感性： 胎鼠>新生鼠>成年鼠,2) 化學致癌物方面

45、劑量閾值: 啟動因子（initiator）不表現(xiàn)明顯的劑量閾值 促癌因子（promotor）則有劑量閾值 一般的化學致癌物往往兼有啟動和促癌的作用,因此仍可表現(xiàn)有劑量閾值 如3’-Me-DAB (60ppm)致癌強度: 誘發(fā)大鼠肝癌總劑量:

46、 DAB為1000mg 3’-Me-DAB為600mg, 2-AAF為250mg, DMN只需100mg;,誘癌潛伏期: 誘發(fā)肝癌：AFB1需時約1年, 3’-Me-DAB與2-AAF約半年左右, DEN

47、一般只需3個月;誘癌靶器官: 誘癌譜：相對專一，如3’-Me-DAB一般只引起肝癌, 較廣，如亞硝胺類可誘發(fā)多器官腫瘤; 化學致癌物的相互作用: 多數(shù) 協(xié)同作用而加速致癌, 少數(shù) 會產(chǎn)生拮抗作用. 有的化學物質(zhì)單獨使用時本身不致癌,但可增強致癌物作用（促癌物）,3)誘癌方案（carcinogenic r

48、egimen）和方法,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,半年后,12周后,喂正常飼料(代表1周),喂含0.06%3’Me-DAB的飼料,喂含0.02%2-AAF的飼料,部分肝切除,,,,,,,,苯并蒽(Benzanthracene),直接涂擦皮膚,注射至皮下,產(chǎn)生皮膚癌,產(chǎn)生纖維肉瘤,,非基因毒致癌物(non-genotoxic carcinogen)

49、 美國公布的301種化合物中,162種可致鼠類腫瘤 其中 36%不引起細胞DNA的改變 44%不引起細胞突變 致癌機制？ 促進細胞增殖？ 抑制細胞凋亡？

50、 其它未知？,2 生物因子誘發(fā)動物腫瘤模型 (1) 病毒誘發(fā)動物腫瘤模型 1908年Ellermann和Bang— 白血病雞的無細胞濾液誘發(fā)雞白血病獲成功 白血病、淋巴瘤、肉瘤、乳腺癌、皮膚癌、腎癌等,與病毒感染有關 1) DNA病毒

51、 多瘤病毒(PyV) 皰疹病毒(herpes virus sylvilagas) 2) RNA病毒 急性RNA腫瘤病毒：潛伏期較短(3～4周),大部分肉瘤病毒、禽白血病病毒、

52、 個別小鼠白血病病毒(如Abl-MuLV)都屬于本組. 該組病毒基因組結(jié)構常有缺陷,需輔助病毒協(xié)助才能復制 慢性RNA腫瘤病毒： 潛伏期較長(4～12月)，大部分動物白血病病毒屬于本組,（2）其它生物因子誘發(fā)的動物腫瘤模型 幽門螺桿菌感染SPF級的BALB/c小

53、鼠,22月以后, 38%的實驗小鼠胃有淋巴濾泡增生, 25%的小鼠胃出現(xiàn)形態(tài)類似人胃粘膜相關淋巴瘤的病變 （B細胞淋巴瘤）,3. 轉(zhuǎn)基因動物腫瘤模型 ▲St

54、ewart等獲得13個MMTV-LTR/myc融合基因的轉(zhuǎn)基因小鼠系, 其中兩株c-myc啟動子為MMTV-LTR啟動子中糖皮質(zhì)激素受體 反應元件所取代,在早期妊娠時即發(fā)生自發(fā)性乳腺癌。 ▲Chisari等 HHBV的S基因、病毒增強子和X基因→轉(zhuǎn)基因小鼠, HBsAg的積聚引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴張,出現(xiàn)肝細胞毛玻璃樣改變, 10

55、0%小鼠發(fā)生肝臟腫瘤 X基因和病毒增強子的質(zhì)?！鶻基因轉(zhuǎn)基因小鼠, 21月齡時, 兩個品系轉(zhuǎn)基因小鼠肝腫瘤發(fā)生率分別為 75% 82.8%

56、,三、移植性腫瘤 可移植瘤株：將一種動物腫瘤移植到同系同種或異種動物,經(jīng)傳 代（20代）, 組織形態(tài)特征逐漸穩(wěn)定，即成為同種 或異種動物的可移植瘤株。 移植瘤來源：動物自發(fā)性腫瘤或誘發(fā)性腫瘤 我國用615近交系小鼠的自發(fā)瘤建立了：

57、 肺癌、肝癌、乳腺癌、白血病等移植瘤株 用誘發(fā)瘤建立了： 小鼠宮頸癌（U27及U14） 小鼠前胃癌（Fc） 肝細胞癌等移植瘤株。,近交系動物的

58、應用： 1962年,蘇格蘭醫(yī)師Dssacson和 Cattanach發(fā)現(xiàn)（裸小鼠） *移植性人腫瘤裸鼠模型廣泛應用 1、免疫缺陷動物         (1) T細胞免疫功能缺陷動物 裸小鼠：*先天性胸腺發(fā)育不良(妊娠14～15天可見少量胸

59、腺 痕跡,并非全無胸腺) *胸腺依賴性T細胞明顯減少或缺乏, *B細胞仍然存在,但功能低下,免疫球蛋白以IgM為主, *NK細胞有較強活力。 純合子的裸大鼠：基因符號rnu。

60、特征與裸小鼠相似 無胸腺大鼠,(2)B細胞免疫功能缺陷動物 B細胞功能衰退,血漿IgM、IgG低下,T細胞功能尚屬正常 CBA/N系小鼠 Arabian和Quarter馬 (3)聯(lián)合免疫缺陷及其它免疫缺陷動物 C

61、BA/N—NU小鼠 T、B淋巴細胞功能均缺陷; 嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠（SCID）：突變基因scid位于第16對染色體 純合子小鼠T、B淋巴細胞極度低下,

62、 NK細胞和抗原傳遞細胞功能尚正常 先天性聯(lián)合免疫缺陷型小鼠： NK細胞、T、B細胞功能聯(lián)合缺陷裸小鼠： 缺點：*需在 germ-free或SPF條件下飼養(yǎng)，較苛刻

63、 *平均壽命僅14～30d。,2、人腫瘤免疫缺陷動物模型 移植成功率: 取決于 移植方法：人癌組織直接移植的成功率平均為30% 人癌細胞株為60～70% 腫瘤本身：成功率最高—結(jié)腸癌、胃癌、黑色素瘤; 其

64、次—胰腺癌裸小鼠胰腺內(nèi)原位移植、宮頸癌、食管癌等; 較低—前列腺癌、乳腺浸潤癌、淋巴網(wǎng)織系統(tǒng)腫瘤和白血病 裸小鼠品系：人前列腺癌—BALB/c成功率僅2%（3/150） NMRI裸小鼠可達35%（6/16） 其它：

65、 接種部位 宿主遺傳背景 年齡和建康狀況等,(1)人組織裸鼠誘癌模型  誘發(fā)鼻咽癌 青少年慢性鼻咽增殖體炎鼻咽活檢或刮除組織移植于NC系裸小鼠 二亞硝基哌嗪（NDP）為致癌劑 鼻咽上皮增生 巴豆油A因子（TP

66、A）為促癌劑 乳頭狀增生、不典型增生 原位癌 誘發(fā)肺癌 裸鼠體內(nèi)人類氣管、支氣管培養(yǎng)成功也為用人材料誘發(fā)肺癌的實驗奠定了基礎,,(2)人腫瘤裸鼠移植模型 *1969年

67、丹麥的Ryggard 人結(jié)腸癌移植于裸小鼠 *100余種人類惡性腫瘤裸小鼠移植模型： 癌腫 肝、肺、胃、結(jié)腸、食管、胰腺、乳腺、 前列腺、鼻咽、

68、 淋巴造血系統(tǒng)腫瘤 軟組織腫瘤 其它 黑色素瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤*1978年Festing首次進行裸大鼠人癌異種移植*1983年我國建成甲胎蛋白陽性裸大鼠人肝癌模型LTNR與LTMR2兩株,(3)人腫瘤轉(zhuǎn)移裸鼠模型 我國始于80

69、年代中期 肺癌、肝癌轉(zhuǎn)移及胃癌肝轉(zhuǎn)移和淋巴道轉(zhuǎn)移等1)人肺癌高轉(zhuǎn)移裸小鼠模型 吳秉銓等將6株人肺癌細胞系移植BALB/cA,nu/nu/JCLB裸小鼠 其中一株肺巨細胞癌細胞系移植建成高轉(zhuǎn)移模型,定名為PG 帶瘤存活30天以上裸小鼠中 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(29/30) 肺轉(zhuǎn)移(26/30

70、) 傳17代后,瘤組織再移植裸小鼠(存活30天) 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 (12/12) 肺轉(zhuǎn)移(9/12) 轉(zhuǎn)移率達100% 2)人肝癌高轉(zhuǎn)移裸小鼠模型 孫肪憲,湯釗猷等用30例人肝癌組織直接移植于4～6周齡的BALB/cA,nu/nu裸小鼠, 移