腎臟病相關(guān)的免疫學(xué)檢查

1、腎臟病相關(guān)的免疫學(xué)檢查,,北大醫(yī)院腎內(nèi)科 陳旻,主要內(nèi)容,ANCA抗GBM抗體免疫球蛋白補(bǔ)體,抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體（ANCA）,Anti-neutrophil Cytoplasmic Autoantibodies,概念,以中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞胞漿成份為特異性靶抗原的自身抗體可存在某些小血管炎病人血清中,背景,1982年 Davies等首次報(bào)道1985年 van der Woude等發(fā)現(xiàn)ANCA和WG相關(guān)19

2、87年 Savage等發(fā)現(xiàn)ANCA和MPA相關(guān)1988年 Falk和Jennette發(fā)現(xiàn)部分少免疫復(fù)合物 型節(jié)段壞死性腎小球腎炎血清可測到 ANCA,小血管炎特點(diǎn),全身系統(tǒng)性疾病，缺乏特異臨床表現(xiàn)，早期診斷有時(shí)比較困難；發(fā)病兇險(xiǎn)，進(jìn)展迅速，可出現(xiàn)肺出血和ARF， 嚴(yán)重者危及生命。ARF：53.8% 肺出血：24.4%,我科的統(tǒng)計(jì)資料從發(fā)病到檢測ANCA的時(shí)間（500例患者）：平均237

3、.6天，中位數(shù)為60天 1個(gè)月內(nèi)確診者：23.2%3個(gè)月內(nèi)確診者：47.2%1年以上確診者： 11.0%最長1例長達(dá)4年,Chen M, et al. Postgrad Med J 2005, 81,723-7,ANCA陽性小血管炎發(fā)生率,西方國家最常見的自身免疫性疾病英國：發(fā)病率僅次于RA我國：不少見北京大學(xué)腎臟病研究所近8年共新診斷700例確診的人數(shù)逐年增加,發(fā)病率確實(shí)在增加？醫(yī)生對(duì)該疾病的認(rèn)識(shí)深入？,ANCA意

4、義,ANCA是小血管炎的特異性血清診斷工具ANCA滴度變化與病情相關(guān) 診斷小血管炎判斷活動(dòng)性估計(jì)復(fù)發(fā),系統(tǒng)性血管炎,以血管壁的炎癥和纖維素樣壞死為病理特征的一組疾?。╲asculitides）分類原發(fā)性和繼發(fā)性原發(fā)性血管炎的分類目前通用1994年Chapel Hill血管炎命名分類Jennette et al. Arthritis Rheum 1994;37:187-192,血管的解剖分類,大

5、血管 中等血管 小血管 （內(nèi)臟血管）,大動(dòng)脈主動(dòng)脈,中動(dòng)脈、小動(dòng)脈,微小動(dòng)脈、毛細(xì)血管、小靜脈,系統(tǒng)性血管炎命名分類（Chapel Hill， 1994）,大血管巨細(xì)胞（顳）動(dòng)脈炎Takayasu動(dòng)脈炎（高安病，大動(dòng)脈炎）中血管結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎（經(jīng)典型結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎）Kawasaki ?。ùㄆ椴。┬⊙茼f格納肉芽腫?。╓egener’s granulomatosi

6、s, WG）變應(yīng)性肉芽腫性血管炎（Churg-Strauss syndrome, CSS）顯微鏡下型多血管炎（Microscopic polyangiitis, MPA）過敏性紫癜原發(fā)性冷球蛋白血癥性血管炎皮膚白細(xì)胞碎裂性血管炎Jennette et al. Arthritis Rheum 1994;37:187-192,ANCA檢測方法,一、間接免疫熒光法Indirect immunofluorescence

7、， IIF 二、酶聯(lián)免疫吸附Enzyme Linked Immunosorbance Assay， ELISA,間接免疫熒光法,最常用、經(jīng)典，方法簡便缺點(diǎn)：不易區(qū)分ANA，主觀性,IIF多見兩種熒光模式,胞漿型 cANCA 胞漿內(nèi)呈粗大顆粒，不均勻分布，靶抗原主要為PR3,環(huán)核型pANCA 熒光沿細(xì)胞核周圍成線狀分布，靶抗原主要為MPO,,,,,應(yīng)注意與ANA區(qū)別,ANA陽性，特別是強(qiáng)陽性者，單獨(dú)應(yīng)用IIF檢

8、測ANCA是不可取的（需要結(jié)合ELISA）,ANCA檢測方法,二、酶聯(lián)免疫吸附Enzyme Linked Immunosorbance Assay， ELISA總抗原ELISA: 嗜天青顆粒粗制品做抗原 靈敏度、特異性稍差特異性抗原ELISA: 優(yōu)點(diǎn)：可區(qū)分不同靶抗原 特異性好，靈敏度高，主要ANCA檢測手段缺點(diǎn)：價(jià)格昂貴，抗原來源困難,已知

9、的ANCA靶抗原,PR3,cANCA的主要靶抗原抗PR3抗體相對(duì)特異性較高，主要用于診斷WG 中性粒細(xì)胞嗜天青顆粒中被發(fā)現(xiàn)的第三個(gè)中性絲氨酸蛋白酶（前二個(gè)是HLE、CG）由228個(gè)氨基酸所組成 ，分子量29kD可以消化、降解不溶于水的彈力蛋白，還可以消化、降解某些微生物。,髓過氧化物酶（MPO）,pANCA的主要靶抗原之一在中性粒細(xì)胞嗜天青顆粒中含量最為豐富，可以占到細(xì)胞干重的5％ MPO可以催化過氧化氫和鹵素（Cl-）反應(yīng)

10、產(chǎn)生次氯酸，殺死吞噬的微生物。,殺菌/通透性增高蛋白 （BPI）,1995年由Zhao等人發(fā)現(xiàn) 中性粒細(xì)胞內(nèi)最重要的G-菌的內(nèi)源性抗生素 IIF法中不典型ANCA的靶抗原之一 抗BPI抗體多見于慢性炎癥性肺部疾病（特別是長期綠膿桿菌感染者）如囊性纖維化,中性絲氨酸蛋白酶家族的其它成員,人白細(xì)胞彈力蛋白酶（HLE），組蛋白酶G（cathepsin G），PR3和天青殺素（azurocidin） 消化、降解許多細(xì)胞外基質(zhì) 殺菌、抑

11、菌的能力,其它,乳鐵蛋白防御素（defensins）和?-葡萄糖醛酸酶（?-glucoronidase） 等等,ANCA相關(guān)疾病,一、 原發(fā)系統(tǒng)性小血管炎韋格納氏肉芽腫 WG顯微鏡下多血管炎 MPA過敏性肉芽腫性血管炎 CSSANCA相關(guān)壞死性新月體性腎小球腎炎 NCGN （原發(fā)性小血管炎的腎臟局限型）,ANCA相關(guān)疾病,二、其它過敏性紫癜結(jié)締組織?。篠LE、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎炎癥性腸?。簼?/p>

12、瘍性結(jié)腸炎、克隆病自身免疫性肝病、原發(fā)性硬化性膽管炎感染性疾?。耗倚岳w維化、寄生蟲感染（溶組織阿米巴、盤尾絲蟲?。?、病毒感染（HIV）藥物： 肼苯噠嗪、丙基硫氧嘧啶,抗原特異性ELISA、IIF和疾病的關(guān)系,C-ANCA/抗PR3抗體的臨床意義（歐洲14個(gè)中心的評(píng)估報(bào)告）,,Hagen et al. Kidney Int 1998;53:743,P-ANCA/抗MPO抗體的臨床意義（歐洲14個(gè)中心的評(píng)估報(bào)告）,,Hagen

13、et al. Kidney Int 1998;53:743,C-ANCA和抗PR3抗體同時(shí)陽性用于診斷WG的敏感性為73%P-ANCA和抗MPO抗體同時(shí)陽性用于診斷MPA和iRPGN的敏感性分別為67%和82%特異性達(dá)99%,Hagen et al. Kidney Int 1998;53:743,總結(jié),ANCA是小血管炎的特異性血清學(xué)診斷工具，且有助于指導(dǎo)治療，估計(jì)復(fù)發(fā)目前，只有anti-PR3和anti-MPO具有較明確的臨床價(jià)

14、值,抗腎小球基底膜抗體,Anti-Glomerular basement membrane autoantibodies，Anti-GBM,抗GBM抗體相關(guān)疾病,定義：是指在循環(huán)中或臟器中沉積了抗GBM抗體的 一組臨床疾病臨床分類： 1 急進(jìn)性腎炎I型：抗GBM抗體陽性，無肺出血， 新月體性腎小球腎炎 2 Goodpasture?。喝?lián)征—新月體性腎炎、 肺出血、抗GBM抗體

15、 3 抗GBM抗體陽性，臨床表現(xiàn)較輕的腎小球腎炎，無明顯腎功損害,急進(jìn)性腎炎 rapidly progressive glomerulonephritis,臨床征候群 急性腎炎綜合征 短期內(nèi)出現(xiàn)少尿或無尿 腎功能迅速惡化病理表現(xiàn) 多為新月體性腎炎（50%，50%）,新月體性腎炎Crescentic Glomerulonephritis,分型（根據(jù)免疫熒

16、光病理分為三型）I型 抗腎小球基底膜（GBM）抗體型 抗GBM抗體沿腎小球基底膜線樣沉積II型 免疫復(fù)合物型III型 少免疫沉積型（pauci-immune) 未見或微量免疫復(fù)合物沉積,I型中合并ANCA（+）者為IV型，不合并ANCA者仍為I型III型中ANCA（-）者為V型，ANCA（+）者為III型,在熒光病理的基礎(chǔ)上根據(jù)血清學(xué)又可分為五型,新月體腎炎病理分型與抗GBM及ANCA,抗GBM抗體檢測

17、的重要性,預(yù)后兇險(xiǎn)，早期血漿置換可有一定的療效臨床出現(xiàn)少尿無尿、Scr大于700umol/L、病理新月體大于85%則預(yù)后不良。,GBM抗原,?3(IV)NC1 （IV型膠原 ?3鏈 非膠原1區(qū)）正常隱匿，環(huán)境或其它因素可誘使其暴露,抗GBM抗體檢測方法,間接免疫熒光IIF正常人新鮮冰凍腎組織切片為底物，不易保存典型熒光：線條樣沿GBM沉積敏感性、特異性不好，主觀性,抗GBM抗體檢測方法,酶聯(lián)免疫法   EL

18、ISA膠原酶消化后的可溶性人GBM的抗原 蛋白成分（包括IV型膠原?3鏈NC1區(qū)），易于保存敏感性、特異性較高，可達(dá)95%以上判定結(jié)果客觀，可定量對(duì)疾病的診斷和療效判定有很大意義,,,,IIF法,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Ag 加待測血清 加二抗,IIF法,,,,,,,,,,,陰性血清,陽性或待測血清,IIF法,玻片標(biāo)記、標(biāo)號(hào)PBS 1:10 稀釋

19、血清，每點(diǎn)加30ul（陽性、陰性、待測血清）濕盒中，室溫，30’PBS洗3次，每次1’以上加 PBS 1：4稀釋（二抗）熒光素標(biāo)記羊抗人IgG 20ul/點(diǎn)室溫，30’PBS洗1分鐘以上熒光顯微鏡下讀片,,,,,抗原特異性ELISA法檢測ANCA及抗GBM抗體,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Ag 加待測血清 加二抗,抗原特異性ELISA法檢測ANCA及抗

20、GBM抗體,+ - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10,Ag+Ag-,+陽性血清 -陰性血清 1-10待測血清,方法,1. 包被酶標(biāo)板: 抗原包被孔—PR3、MPO、GBM 非抗原包被孔—碳酸鹽緩沖液 2. 孵育：37ºC，60’ 3.  洗板：PBS/Tween20

21、 2次，拍干 4. 一抗：血清1:50稀釋（陽性、陰性、待 檢） 5. 孵育：37ºC，30’,方法,6. 洗：PBS/Tween20 3次，拍干 7. 二抗：羊抗人IgG (HRP) 1:2000稀釋 8. 孵育：37ºC，30’ 8. 洗：PBS/Tween20 3次，拍干 9. 底物緩沖液 10. 顯色：37ºC，5~10分鐘 11. 終止反應(yīng)：1M

22、 硫酸12.測OD值：?=490nm（酶標(biāo)儀）,數(shù)據(jù)處理,血清OD值: 抗原包被孔平均OD值—非抗原包被 孔平均OD值建立回歸曲線：陰性5%，陽性100%，算 出待檢%正常值建立：50~100份正常人血清，分 別算出%，均值?3SD,,,,?,,,,% 100% 1

23、9% 5%,0.2 X 1.4 OD,,我科正常值,抗MPO-ANCA 23%抗PR3-ANCA 17%抗GBM 13%,送檢要求,取3ml血，不抗凝，血清，病歷摘要（詳細(xì)）ANCA 120元，GBM 50元 （注明聯(lián)系電話）郵寄地址：北京西城區(qū)西什庫大街8號(hào) 北京

24、大學(xué)第一醫(yī)院腎內(nèi)科郵編：100034聯(lián)系人：許遠(yuǎn)，龐維電話：010-66551122-2562,咨詢、轉(zhuǎn)病人或隨訪（010）66551736陳旻大夫——關(guān)于小血管炎崔昭大夫——關(guān)于抗GBM抗體病,免疫球蛋白,由漿細(xì)胞合成和分泌 單體的基本結(jié)構(gòu) ：兩條輕鏈和兩條重鏈重鏈類型：μ、γ、α、δ、ε（根據(jù)重鏈命名）輕鏈類型：κ、λ,檢測方法,IgG、IgA、IgM的測定瓊脂單向擴(kuò)散法 火箭免疫電泳法 其它

25、：包括免疫透射濁度法、終點(diǎn)散射比濁法等 IgD和IgE：含量很低，需要應(yīng)用敏感性很高的方法 放射免疫技術(shù) 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）,腎臟病時(shí)血清Ig的變化,多克隆性增高 慢性感染、慢性肝病、淋巴系統(tǒng)腫瘤和結(jié)締組織病SIE腎損害、冷球蛋白腎損害、狼瘡性腎炎、干燥綜合征腎損害 單克隆性增高 漿細(xì)胞病腎損害，如多發(fā)性骨髓瘤腎損害減低 NS時(shí)常出現(xiàn)IgG降低，尿中丟失過多,補(bǔ) 體,由三組球蛋白組成 第

26、一組：由9種補(bǔ)體成分組成，C1~C9 第二組：B因子、D因子和P因子，參與補(bǔ)體的旁路活化途徑；第三組：C1抑制物、I因子、H因子、C4結(jié)合蛋白、過敏毒素滅活因子等可經(jīng)兩個(gè)途徑激活經(jīng)典激活途徑旁路激活途徑,單一補(bǔ)體成分（C3和C4）：單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)或火箭免疫電泳 總補(bǔ)體活性：血清與羊致敏RBC抗體共同孵育后，50%的羊RBC溶解所消耗的補(bǔ)體量為一個(gè)CH50單位 C3腎炎因子（C3NeF）：免疫電泳、交叉免疫電泳及綿羊紅細(xì)胞