現(xiàn)代造血理論

1、第一篇 造血細(xì)胞及其檢驗(yàn) 第一章 現(xiàn)代造血理論,造血（hematopoiesis）是指血細(xì)胞的生成過(guò)程。造血干細(xì)胞在造血微環(huán)境中增殖、分化為各類(lèi)血細(xì)胞。造血系統(tǒng)通過(guò)造血器官、造血干細(xì)胞、造血調(diào)控因子等組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)來(lái)維持血液細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡。,第一節(jié) 造血器官和造血微環(huán)境,一、造血器官人體的造血器官是生成血液的器官起源于中胚葉，主要包括骨髓、胸腺、淋巴結(jié)、 肝臟和脾等其造血過(guò)程分為胚胎期造血和出生后造血,（一）胚胎期造血

2、器官,人類(lèi)的血液細(xì)胞首先在卵黃囊中形成，肝、脾、胸腺和骨髓均參與造血根據(jù)發(fā)育過(guò)程中造血中心的轉(zhuǎn)移，胚胎期造血又分為三個(gè)時(shí)期： 卵黃囊造血期 、肝造血期 、骨髓造血期,1．卵黃囊造血期（中胚葉造血期）始于胚胎3周左右，卵黃囊壁上的中胚層細(xì)胞開(kāi)始分化聚集成團(tuán)，稱(chēng)為血島（blood island）。血島是人類(lèi)最初的造血中心。血島外周的細(xì)胞逐漸變長(zhǎng)，分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞,血島中央的細(xì)胞形成多能造血干細(xì)胞，繼爾分化成幼稚紅細(xì)胞，以

3、后大量的多能造血干細(xì)胞遷移至肝、脾、骨髓和淋巴組織繼續(xù)增殖、分化為干細(xì)胞。胚胎 2個(gè)月后，卵黃囊逐漸退化、萎縮,被肝、脾取代其造血功能。,2．肝造血期 始于胚胎第6周，是卵黃囊血島的造血干細(xì)胞移植到肝臟的結(jié)果，以造紅細(xì)胞為主，后期可生成粒細(xì)胞和巨核細(xì)胞。肝臟是胚胎2~5個(gè)月的造血中心，持續(xù)至第7個(gè)月時(shí)，逐漸被骨髓造血替代。此外脾、胸腺、淋巴結(jié)等也參與造血。,胎肝造血的規(guī)律：造血細(xì)胞分布在肝竇、肝細(xì)胞索之間。胎肝造血以幼稚紅

4、細(xì)胞為主，巨核細(xì)胞常與紅系細(xì)胞在一起。胎肝造血細(xì)胞的密度隨妊娠日期的不同而變化。證明肝造血在第15周以前為上升期，15~30周為旺盛期，24周以后為減退時(shí)期，至出生前停止。故肝造血為第二代造血。,脾造血 始于胚胎第3個(gè)月，主要生成紅細(xì)胞、粒細(xì)胞，第5個(gè)月時(shí)產(chǎn)生淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞，而紅細(xì)胞和粒細(xì)胞的產(chǎn)生逐漸減少。至出生時(shí)，脾已成為產(chǎn)生淋巴細(xì)胞的器官。胸腺 在胚胎期主要產(chǎn)生淋巴細(xì)胞和少量紅細(xì)胞、粒細(xì)胞，胚胎后期成為誘導(dǎo)和分化T

5、淋巴細(xì)胞的器官。淋巴結(jié) 在胚胎早期可產(chǎn)生紅細(xì)胞，但時(shí)間很短，在胚胎4個(gè)月以后，成為終生制造淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞的器官。,3．骨髓造血期 自胚胎第14周骨髓開(kāi)始造血，5個(gè)月以后成為胚胎期的造血中心。骨髓中的造血干細(xì)胞來(lái)源于肝、脾的種植，可維持終生。胚胎期的骨髓主要生成紅細(xì)胞、粒細(xì)胞和巨核細(xì)胞，也生成淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。,胚胎期造血的三個(gè)時(shí)期是不能截然分開(kāi)，而是此消彼長(zhǎng)，互為交錯(cuò)。,（二）出生后造血,出生后造血主要靠骨髓。在正常情

6、況下骨髓是唯一能產(chǎn)生紅細(xì)胞、粒細(xì)胞和血小板的場(chǎng)所，也生成淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。脾和淋巴結(jié)為終生制造淋巴細(xì)胞的器官。,1．骨髓 骨髓是位于骨髓腔內(nèi)的海綿樣膠狀組織，有紅骨髓和黃骨髓之分。嬰幼兒的骨髓幾乎都參與造血，即全為紅骨髓。大約從5歲開(kāi)始，長(zhǎng)骨的髓腔內(nèi)出現(xiàn)脂肪細(xì)胞，隨年齡增長(zhǎng)，長(zhǎng)骨遠(yuǎn)端的紅骨髓逐漸被脂肪組織代替轉(zhuǎn)化為黃骨髓。,到18歲以后，紅骨髓只限于顱骨、脊椎骨、肋骨、胸骨、骼骨以及長(zhǎng)骨的近心端。因此，在作骨髓穿刺或活檢

7、時(shí)，成人可選擇的部位是骼骨、棘突、胸骨等處，脛骨粗隆則只適用于2歲以下的幼兒。成人的紅骨髓和黃骨髓約各占50%，但黃骨髓仍有造血潛能，當(dāng)機(jī)體需要時(shí)又轉(zhuǎn)變?yōu)榧t骨髓而參與造血。,2.淋巴器官 分為中樞淋巴器官和周?chē)馨推鞴佟Ｖ袠辛馨推鞴僦饕ㄐ叵俸凸撬?，主?dǎo)淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生、增殖、分化和成熟。周?chē)馨推鞴僦饕馨徒Y(jié)、脾、腸粘膜相關(guān)淋巴組織等，是淋巴細(xì)胞聚集和免疫應(yīng)答發(fā)生的場(chǎng)所。,(1)胸腺（thymus）來(lái)自骨髓的淋巴干細(xì)

8、胞經(jīng)增殖和在胸腺素的作用下，誘導(dǎo)分化為免疫活性細(xì)胞，進(jìn)入胸腺髓質(zhì)，然后釋放入血并遷移到外周淋巴器官的胸腺依賴(lài)區(qū)成為胸腺依賴(lài)淋巴細(xì)胞即T細(xì)胞。青春期后，胸腺逐漸退化，被脂肪組織取代。,(2)淋巴結(jié)（lymph node）淋巴結(jié)的外周部分為皮質(zhì)，B細(xì)胞在淋巴結(jié)皮質(zhì)區(qū)濾泡中央增殖、發(fā)育；皮質(zhì)深層和濾泡間隙為副皮質(zhì)區(qū)，富含由胸腺遷移而來(lái)的T細(xì)胞，又稱(chēng)胸腺依賴(lài)區(qū)；淋巴結(jié)中央部分為髓質(zhì)，髓質(zhì)區(qū)的B細(xì)胞、漿細(xì)胞及巨噬細(xì)胞集結(jié)構(gòu)成髓索,(3)脾

9、脾切面大部分呈暗紅色，稱(chēng)紅髓，其中散布著許多灰白色小結(jié)節(jié)，為白髓。白髓是淋巴細(xì)胞的聚集處，在中央小動(dòng)脈周?chē)饕荰細(xì)胞，是脾的胸腺依區(qū)；白髓中的脾小結(jié)位于脾動(dòng)脈周?chē)馨颓蕛?nèi)一側(cè)，內(nèi)有生發(fā)中心，主要由B細(xì)胞構(gòu)成。脾具有造血、儲(chǔ)血及免疫等多種功能，是T、B細(xì)胞分化成熟的主要場(chǎng)所之一。,3.髓外造血正常情況下，胎兒出生2個(gè)月以后，骨髓以外的組織如肝、脾淋巴結(jié)等不再制造紅細(xì)胞、粒細(xì)胞和血小板。但在某些病理情況下，如骨髓纖維化、骨髓增生

10、性疾病及某些貧血，這些組織又恢復(fù)造血功能（常可導(dǎo)致相應(yīng)器官腫大），稱(chēng)為髓外造血。,髓外造血是機(jī)體對(duì)血細(xì)胞的需求特別增高或?qū)撬柙煅系K的一種補(bǔ)償，尤其常見(jiàn)于兒童。這種代償作用有限且不完善。髓外造血部位除肝、脾、淋巴結(jié)外，也可以累及胸腺、腎、腎上腺、腹腔后脂肪及胃腸道。,二、造血微環(huán)境,造血微環(huán)境（hematopoietic microenvironment）是指造血細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育的內(nèi)環(huán)境。由微血管系統(tǒng)、末梢神經(jīng)、基質(zhì)、基質(zhì)細(xì)胞及

11、基質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子等組成，不僅是造血細(xì)胞的支架，還可通過(guò)細(xì)胞之間的相互作用和釋放的細(xì)胞因子影響造血活動(dòng)。,（一）骨髓微血管系統(tǒng),骨髓微血管系統(tǒng)是造血微環(huán)境的重要組成部分,其功能在于向造血組織輸送營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，排出代謝廢物，從而有利于造血細(xì)胞的更新。毛細(xì)血管注人管腔膨大的靜脈竇，再彼此溝通匯集成集合竇，最后進(jìn)人中央靜脈。靜脈竇與集合竇（統(tǒng)稱(chēng)為骨髓血竇）是骨髓血管系統(tǒng)的核心結(jié)構(gòu)。,血竇（Sinusoid） 是動(dòng)脈毛細(xì)血管分成的不規(guī)則竇狀

12、腔隙。血竇內(nèi)是成熟的血細(xì)胞，血竇之間則充以骨髓實(shí)質(zhì)(造血索)，主要是活躍的造血實(shí)質(zhì)細(xì)胞。血竇壁是由連續(xù)的內(nèi)皮細(xì)胞、顆粒狀基底膜和外皮細(xì)胞所組成，其竇壁的薄厚是可變的,絕大多數(shù)的竇壁僅有一層內(nèi)皮細(xì)胞組成，平時(shí)無(wú)孔，當(dāng)血細(xì)胞穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)形成臨時(shí)通道。,不同造血功能的骨髓其微血管的結(jié)構(gòu)不同造血功能旺盛時(shí)，骨髓血竇很豐富，竇壁孔隙增多；造血功能低下的骨髓，骨髓血竇減少，無(wú)造血功能的黃骨髓中，微血管呈毛細(xì)管狀。骨髓的微血管系統(tǒng)通過(guò)調(diào)節(jié)

13、物質(zhì)與能量的交換、血細(xì)胞的釋放、組織內(nèi)的酸堿度、氧和二氧化碳分壓等影響造血細(xì)胞的增殖和分化。,（二）骨髓神經(jīng),骨髓的神經(jīng)來(lái)源于脊神經(jīng)，其神經(jīng)供應(yīng)十分廣泛，骨髓的全部動(dòng)脈都伴有神經(jīng)束，其分支纏繞于動(dòng)脈壁呈網(wǎng)狀，神經(jīng)纖維終止于動(dòng)脈壁的平滑肌纖維。骨髓小動(dòng)脈上的交感神經(jīng)纖維受延髓血管運(yùn)動(dòng)中樞的控制，但絕大多數(shù)的骨髓微血管床主要受血管活性物質(zhì)的調(diào)節(jié)。,骨髓神經(jīng)的作用：（1）通過(guò)調(diào)節(jié)血管的舒縮，改變血竇的大小及血流速度的快慢等影響造血（2）

14、神經(jīng)分泌的體液因子可直接作用于造血細(xì)胞（3）基質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)造血功能,（三）基質(zhì)細(xì)胞及其分泌的調(diào)控因子,骨髓基質(zhì)細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等，它們通過(guò)與造血干細(xì)胞的密切接觸起到支持和營(yíng)養(yǎng)造血細(xì)胞的作用。各種基質(zhì)細(xì)胞都有分泌細(xì)胞因子的功能，其分泌的生物大分子物質(zhì)都與造血細(xì)胞的粘附有關(guān)，可粘附固定造血細(xì)胞。,基質(zhì)細(xì)胞還分泌多種細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素、FLT-3配基、干細(xì)胞因子、粒一巨噬細(xì)胞集落刺激因子

15、、粒細(xì)胞集落刺激因子、巨噬細(xì)胞集落刺激因子等，這些細(xì)胞因子不僅直接作用于造血細(xì)胞，而且作用于基質(zhì)細(xì)胞，改變基質(zhì)細(xì)胞的增殖和分泌狀況，誘導(dǎo)其它細(xì)胞因子的生成。對(duì)造血細(xì)胞的增殖、分化和發(fā)育成熟起重要的調(diào)控作用。,Go on....,第二節(jié) 造血細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育和造血調(diào)控,一、造血細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育胚胎造血組織的發(fā)育是血細(xì)胞發(fā)生、發(fā)育研究的基礎(chǔ)，也是血液學(xué)研究必不可少前提。造血細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)連續(xù)不斷的復(fù)雜過(guò)程，造血器官內(nèi)的各種造血細(xì)

16、胞在造血微環(huán)境中通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用，在各種細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下，按一定的規(guī)律發(fā)育成為各種成熟的血細(xì)胞，然后釋放入血循環(huán)中。,（一）造血細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的概念,造血細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育包括增殖、分化、成熟和釋放四個(gè)方面。造血細(xì)胞的增殖是指血細(xì)胞通過(guò)分裂而使其數(shù)量增加的過(guò)程。有絲分裂是造血細(xì)胞的主要增殖方式。,母細(xì)胞有絲分裂后形成的子細(xì)胞同時(shí)都傾向分化成熟。子細(xì)胞還可進(jìn)一步增殖，每增殖一次就越傾向于進(jìn)一步分化。一般來(lái)講，一個(gè)原始細(xì)胞到成

17、熟細(xì)胞可經(jīng)過(guò)4~5次分裂，如1個(gè)原始紅細(xì)胞可產(chǎn)生32個(gè)或64個(gè)成熟紅細(xì)胞。而巨核細(xì)胞的增殖（連續(xù)雙倍增殖DNA）與其他系統(tǒng)血細(xì)胞的增殖方式不同，每增殖一次，核增大一倍，但胞質(zhì)并不分裂，屬多倍體細(xì)胞，形態(tài)上也表現(xiàn)為從原始到成熟胞體逐漸變大。,造血細(xì)胞的分化（differentiation）是指細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中失去某些潛能又獲得新的功能的過(guò)程，即由多潛能轉(zhuǎn)變?yōu)閱螡撃艿倪^(guò)程。分裂后的細(xì)胞在形態(tài)和功能上產(chǎn)生了新的特征，分化過(guò)程是不可逆的。,

18、造血細(xì)胞的成熟（maturation）是細(xì)胞從造血干細(xì)胞定向分化后，從原始經(jīng)幼稚到成熟的細(xì)胞發(fā)育過(guò)程，血細(xì)胞越成熟其形態(tài)越易辨認(rèn)，功能也日趨完善。,成熟的血細(xì)胞在骨髓內(nèi)通過(guò)“髓血屏障”釋放入血循環(huán)中，各種調(diào)節(jié)因素控制著血細(xì)胞的增殖、分化、成熟和釋放，從而維持血細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量的穩(wěn)定。,（二）造血細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程,根據(jù)造血細(xì)胞的功能和形態(tài)特征，造血細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程可為：造血干細(xì)胞、造血祖細(xì)胞、原始及幼稚細(xì)胞三個(gè)階段。原始及幼稚

19、細(xì)胞階段的細(xì)胞是在骨髓涂片中從形態(tài)學(xué)上可以辨認(rèn)各系各階段的血細(xì)胞。,,,,,造血干細(xì)胞階段,造血組細(xì)胞階段,原始及幼稚細(xì)胞階段,成熟細(xì)胞,二、造血干／祖細(xì)胞,干細(xì)胞（stem cell）是具有自我復(fù)制和多向分化能力的細(xì)胞。早期胚胎中的原始生殖細(xì)胞即胚胎干細(xì)胞，具有廣泛的發(fā)育和分化潛能，稱(chēng)為全能干細(xì)胞（totipotent hematopoietic stem cell,T HSC）。胚胎干細(xì)胞可分化為各類(lèi)組織干細(xì)胞，造血組織中存在造

20、血干細(xì)胞、血管干細(xì)胞和間質(zhì)干細(xì)胞。,（一）造血干細(xì)胞,造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell, HSC）的概念于20世紀(jì)初就有人提出，但當(dāng)時(shí)的含義不甚明確，研究?jī)?nèi)容模糊不清，直至發(fā)現(xiàn)了脾集落形成單位之后，造血干細(xì)胞在六七十年代引起了人們的關(guān)注。隨著新技術(shù)的發(fā)展，造血干細(xì)胞在臨床應(yīng)用等方面潛在的巨大價(jià)值被逐步發(fā)現(xiàn)，目前已成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱門(mén)課題。,造血干細(xì)胞又稱(chēng)多能干細(xì)胞，由中胚層細(xì)胞分化而來(lái)，是各種血細(xì)胞的始

21、祖，具有高度自我更新、多向分化和增殖能力，并且在造血組織中含量極少，其形態(tài)酷似小淋巴樣細(xì)胞而難以辨認(rèn)。在體內(nèi)造血干細(xì)胞多數(shù)處于G0期。造血干細(xì)胞可增殖分化為髓系干細(xì)胞和淋巴干細(xì)胞。,1.造血干細(xì)胞的基本特征(1)自我更新：即細(xì)胞通過(guò)有絲分裂產(chǎn)生的兩個(gè)子代細(xì)胞與親代細(xì)胞具有相同的特征。造血干細(xì)胞的自我更新是維持其數(shù)量平衡的基礎(chǔ)，亦稱(chēng)自我維持。高度的自我更新能力是造血干細(xì)胞基本的生物學(xué)特征之一。,(2）多向分化：即造血干細(xì)胞具備分化為

22、各系造血祖細(xì)胞的潛能，是造血干細(xì)胞的另一個(gè)基本的生物學(xué)特征，造血干細(xì)胞的分化受到多種正負(fù)調(diào)控因子的調(diào)節(jié)，在特定的條件下可以分化成紅細(xì)胞、粒細(xì)胞（中性、嗜酸性、嗜堿性）、單核細(xì)胞、血小板、組織嗜堿細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞等的祖細(xì)胞。分化是不可逆的，造血干細(xì)胞一旦定向分化為某種祖細(xì)胞，就不可能再變成其他的祖細(xì)胞。,2．造血干細(xì)胞檢測(cè) 單個(gè)細(xì)胞在生物體內(nèi)有能力長(zhǎng)期重建造血是判斷該細(xì)胞為造血干細(xì)胞的“金標(biāo)準(zhǔn)”。由于造

23、血干細(xì)胞的數(shù)量極少，且形態(tài)上不能區(qū)別，也沒(méi)有造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志，目前還沒(méi)有建立體外直接測(cè)定造血干細(xì)胞的方法。,（1）脾集落測(cè)試法 1961年Till等首先采用體內(nèi)試驗(yàn)小鼠脾集落形成間接證明了造血干細(xì)胞的存在：將受體小鼠以致死劑量射線(xiàn)照射后，破壞全部造血細(xì)胞，動(dòng)物因造血功能衰竭而死亡；如輸以供體骨髓或血液，小鼠能存活，并在受體小鼠脾中形成紅系、粒系、巨核系細(xì)胞組成的結(jié)節(jié)即脾集落，經(jīng)證實(shí)所有這些細(xì)胞都是由單個(gè)細(xì)胞增殖分化而來(lái)，即脾集

24、落形成單位（CFU-S）；如將脾結(jié)節(jié)細(xì)胞靜脈注射給受體小鼠，該小鼠也能存活。證實(shí)了骨髓或血液中存在血液細(xì)胞的祖先細(xì)胞。,20世紀(jì)80年代出現(xiàn)了一系列體外檢測(cè)造血干細(xì)胞的試驗(yàn)方法，但只能部分證實(shí)造血干細(xì)胞自我更新和多向分化兩個(gè)特征，如混合集落(CFU-Mix )培養(yǎng)， 高增殖潛能細(xì)胞(HPP-CFC）培養(yǎng)， 原始細(xì)胞集落形成細(xì)胞（CFU-Blast )培養(yǎng)，長(zhǎng)期培養(yǎng)起始細(xì)胞（LTC-IC )檢測(cè)等。,（2）單克隆抗體法 利用F

25、ACS自動(dòng)細(xì)胞分選系統(tǒng)分選出單個(gè)CD34+細(xì)胞亞群細(xì)胞----CD34+CD38+及CD34+CD38—，在無(wú)血清體系中加入各種細(xì)胞因子（如SCF、IL-3、IL-6、GM-CSF及Epo）刺激，結(jié)果表明，CD34+ CD38—單個(gè)細(xì)胞可形成原代集落，并可向紅系、粒系、巨噬系、巨核系等 細(xì)胞分化。證明了CD34+CD38—細(xì)胞的性能接近于造血干細(xì)胞，同時(shí)也證明了造血干細(xì)胞具有多向分化的能力，還有實(shí)驗(yàn)表明，造血干細(xì)胞具有向淋巴細(xì)胞分化的

26、能力。,目前造血干細(xì)胞的表面標(biāo)記尚未確定。一般認(rèn)為CD34陽(yáng)性細(xì)胞具有長(zhǎng)期重建造血的能力，推測(cè)部分造血干細(xì)胞CD34陽(yáng)性；CD34陽(yáng)性CD38陰性細(xì)胞比CD34陽(yáng)性細(xì)胞具有更強(qiáng)的長(zhǎng)期造血能力；AC 133陽(yáng)性細(xì)胞也被認(rèn)為是早期造血細(xì)胞的標(biāo)志。明確造血干細(xì)胞的表面標(biāo)記不但具有重要理論價(jià)值，也有助于分離純化高質(zhì)量的造血干細(xì)胞供臨床應(yīng)用。,（二）造血祖細(xì)胞,造血干細(xì)胞進(jìn)一步分化為各種造血祖細(xì)胞（hematopoietic proge

27、nitor cell）。造血祖細(xì)胞是一類(lèi)由造血干細(xì)胞分化而來(lái)，但失去自我更新能力的過(guò)渡性、增殖性的細(xì)胞群，過(guò)去稱(chēng)為定向干細(xì)胞。,造血祖細(xì)胞有年齡結(jié)構(gòu)，根據(jù)其分化能力，可分為多向祖細(xì)胞和單向祖細(xì)胞，多向祖細(xì)胞可進(jìn)一步分化 為單向祖細(xì)胞。通過(guò)體外造血細(xì)胞半固體培養(yǎng)證實(shí)了造血祖細(xì)胞的存在。,產(chǎn)生紅細(xì)胞的祖細(xì)胞稱(chēng)為： 紅細(xì)胞爆式集落形成單位（BFU-E)（早期） 和紅細(xì)胞集落形成單位(CFU-E),BFU-E,產(chǎn)生粒細(xì)胞和單核

28、細(xì)胞的祖細(xì)胞稱(chēng)為： 粒-單核細(xì)胞集落形成單位（CFU-GM）,CFU-GM,產(chǎn)生巨核細(xì)胞的祖細(xì)胞稱(chēng)： 巨核細(xì)胞集落形成單位（CFU-Meg）,CFU-Meg,另外，產(chǎn)生嗜酸性粒細(xì)胞的祖細(xì)胞稱(chēng)為嗜酸性粒細(xì)胞集落形成單位（CFU-Eo）；產(chǎn)生嗜堿性粒細(xì)胞的祖細(xì)胞稱(chēng)為嗜堿性粒細(xì)胞集落形成單位（CFU-Bas）；產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞的祖細(xì)胞稱(chēng)為T(mén)淋巴細(xì)胞集落形成單位（CFU-TL）；產(chǎn)生B淋巴細(xì)胞的祖細(xì)胞稱(chēng)為B淋巴細(xì)胞集落形成

29、單位(CFU-BL) 。這些祖細(xì)胞失去了自我更新的能力，但有較強(qiáng)的增殖和定向分化能力。造血祖細(xì)胞表面的主要免疫標(biāo)記已明確，因此，根據(jù)這一特性，可采用流式細(xì)胞術(shù)或其他免疫學(xué)技術(shù)來(lái)分析造血祖細(xì)胞，甚至可以使之分離純化。,（三）造血干／祖細(xì)胞的臨床應(yīng)用,造血干／祖細(xì)胞的臨床應(yīng)用主要涉及到造血干／祖細(xì)胞移植。目前造血干／祖細(xì)胞主要來(lái)源于骨髓、外周血和臍血，不同來(lái)源的造血干／祖細(xì)胞的移植在臨床上各有其優(yōu)缺點(diǎn)。,造血干／祖細(xì)胞移植主要應(yīng)用于：

30、1.血液系統(tǒng)惡性腫瘤，如急、慢性白血病等；2.血液系統(tǒng)非惡性腫瘤性疾病，如再生障礙性貧血、異常血紅蛋白病、Fanconi貧血、難治性貧血等；3.實(shí)體腫瘤化療后造血重建，如乳腺癌、卵巢癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等；4.其他，如重癥聯(lián)合免疫缺陷癥、自身免疫性疾病、基因治療等。,三、造血調(diào)控,造血細(xì)胞的增殖、分化受控于不同的調(diào)控系統(tǒng)，以保持各種血細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量的相對(duì)穩(wěn)定。造血調(diào)控作用于血細(xì)胞發(fā)育的每一階段，體內(nèi)許多因素參與了這一過(guò)程，其中細(xì)胞

31、因子的調(diào)控占重要地位。細(xì)胞因子（cytokines）是一組基因編碼的低分子量蛋白質(zhì)細(xì)胞外信號(hào)分子，有的是糖蛋白，有的則不含糖基，在機(jī)體內(nèi)含量極低，半衰期短，主要功能是在細(xì)胞間傳遞信息，從而影響造血活動(dòng)。,（一）集落刺激因子類(lèi)( colony-stimulating factors, CSFs )CSFs在半固體細(xì)胞培養(yǎng)中能促進(jìn)造血細(xì)胞集落形成。主要有以下幾種：1.紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO） 主要的

32、生物學(xué)功能是刺激紅系祖細(xì)胞的增殖和分化，以提高紅細(xì)胞數(shù)量。2.粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF) 除促進(jìn)粒系祖細(xì)胞形成集落外，G-CSF可誘導(dǎo)某些白血病細(xì)胞株分化成熟，激活中性粒細(xì)胞的吞噬功能，誘導(dǎo)早期造血干／祖細(xì)胞從場(chǎng)期進(jìn)人細(xì)胞周期。,3.粒一巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF) GM-CSF除了促進(jìn)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞祖細(xì)胞增殖、分化成熟外，對(duì)成熟細(xì)胞也產(chǎn)生作用4.巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF） 促進(jìn)單核系

33、祖細(xì)胞的增殖和分化，激活巨噬細(xì)胞的吞噬和分泌功能。5.多系集落刺激因子（multi-CSF） 促進(jìn)造血干／祖細(xì)胞的增殖、分化，促進(jìn)多系集落生長(zhǎng)。6.血小板生成素（thrombopoietin, TPO）促進(jìn)造血干／祖細(xì)胞的增殖、分化；促進(jìn)巨核細(xì)胞集落形成。,（二）白細(xì)胞介素（interleukin, IL)白細(xì)胞介素主要是白細(xì)胞產(chǎn)生的信號(hào)分子，不僅在免疫系統(tǒng)中傳遞信息，同時(shí)也參與造血系統(tǒng)的造血調(diào)控，其主要生物學(xué)功能見(jiàn)（臨床免

34、疫學(xué)檢驗(yàn)》。,（三）其他細(xì)胞因子1.干細(xì)胞因子（stem cell factor, SCF） 又稱(chēng)肥大細(xì)胞生長(zhǎng)因子 促進(jìn)肥大細(xì)胞生長(zhǎng)；協(xié)同促進(jìn)造血干／祖細(xì)胞增殖、分化。2．FLT-3配基(FLT-3 ligand, FL) 誘導(dǎo)處于靜止期的造血干／祖細(xì)胞進(jìn)人細(xì)胞周期，促進(jìn)其擴(kuò)增。,目前發(fā)現(xiàn)對(duì)造血有調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子有近50種，它們對(duì)造血的調(diào)控有正向和負(fù)向調(diào)節(jié)，一種細(xì)胞因子對(duì)一類(lèi)細(xì)胞可能以正向調(diào)節(jié)為主，而對(duì)另一類(lèi)細(xì)胞則可能是

35、反向抑制，并且不同的濃度作用效果也不一樣。大多數(shù)人類(lèi)的細(xì)胞因子可以通過(guò)基因工程制備，有的已成功用于臨床，如EPO較早地用來(lái)治療各種貧血，尤其是與腎功能衰竭、化療、腫瘤骨髓浸潤(rùn)有關(guān)的貧血，取得了顯著療效；G-CSF應(yīng)用于治療化療引起的中性粒細(xì)胞減少癥，骨髓移植和外周血造血干／祖細(xì)胞的動(dòng)員等。,第三節(jié) 造血干／祖細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù),體內(nèi)造血干／祖細(xì)胞在一個(gè)極復(fù)雜的造血微環(huán)境中增殖、分化生成血液細(xì)胞。體外造血祖細(xì)胞培養(yǎng)就是在體外模擬體內(nèi)的

36、生理環(huán)境，將從機(jī)體中分離出的造血祖細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使之生存、增殖分化。,造血祖細(xì)胞培養(yǎng)主要應(yīng)用于：1）檢測(cè)造血祖細(xì)胞在骨髓、外周血和臍血中的數(shù)量2）研究體外造血祖細(xì)胞類(lèi)型、特性及生理意義3）利用人工培養(yǎng)條件易于改變并能?chē)?yán)格控制的特點(diǎn)，研究造血調(diào)節(jié)；4）用于造血系統(tǒng)疾病發(fā)生機(jī)制，診斷、預(yù)后判斷、療效觀察及治療藥物的選擇等方面的研究。,一、造血干／祖細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本條件,（一）實(shí)驗(yàn)室條件（二）培養(yǎng)的支持物（三）營(yíng)養(yǎng)液（四）細(xì)胞

37、因子（五）血清,二、造血干／祖細(xì)胞體外培養(yǎng),各種造血祖細(xì)胞的培養(yǎng)條件、體系組成雖有差異，但培養(yǎng)過(guò)程大致相同。 造血祖細(xì)胞的培養(yǎng)步驟如下：（1）分離培養(yǎng)細(xì)胞，并制成單個(gè)核細(xì)胞懸液。（2）配制培養(yǎng)體系：按比例將培養(yǎng)液、細(xì)胞、血清、刺激因子加入培養(yǎng)體系瓶?jī)?nèi)，混勻。（3）將配制的培養(yǎng)體系在37℃水浴，保溫10min。,（4）培養(yǎng)體系保溫的同時(shí)，將瓊脂等支持物煮沸融化（甲基纖維素不需加熱）。（5）待支持物降至40℃左右，加入培養(yǎng)體

38、系并混勻。（6）將混勻后的培養(yǎng)體系加入培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板孔內(nèi)，一般平行做3份。（7）待培養(yǎng)物冷卻凝固后，于5%CO2、飽和濕度及37℃溫箱內(nèi)孵育。CFU-GM需7~10天，CFU-E需7天，BFU-E需14天。（8）觀察結(jié)果。包括記數(shù)集落數(shù)，對(duì)部分難以確定細(xì)胞性質(zhì)的集落應(yīng)固定、染色后分析。,（一）粒一單核細(xì)胞系祖細(xì)胞（CFU-GM）培養(yǎng)【原理】受檢者血液或骨髓經(jīng)過(guò)分離獲得的單個(gè)核細(xì)胞在適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子(GM-CSF)作用下，在體外半固

39、體瓊脂上形成由不同成熟階段的粒細(xì)胞和單核細(xì)胞組成的細(xì)胞集落。每個(gè)集落可視為由一個(gè)粒一單核細(xì)胞系祖細(xì)胞增殖、分化而來(lái)。集落數(shù)的多少可以反映造血細(xì)胞中粒一單核細(xì)胞系祖細(xì)胞的水平。,（二）紅系祖細(xì)胞（BFU-E,CFU-E）培養(yǎng)【原理】在培養(yǎng)體系中加人適量的EPO，使骨髓中的造血細(xì)胞在半固體培養(yǎng)基上形成由紅細(xì)胞組成的集落（BFU-E和CFU-E）。每個(gè)集落可視為一個(gè)紅系祖細(xì)胞增殖分化而來(lái)，集落的多少可反映造血細(xì)胞中紅系祖細(xì)胞的量。,Than