2-蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能(護(hù)本藥學(xué))

1、谷胱甘肽(glutathione, GSH),谷氨酸 半胱氨酸 甘氨酸,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,第二節(jié) 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)The Molecular Structure of Protein,一級(jí)結(jié)構(gòu)(primary structure)二級(jí)結(jié)構(gòu)(secondary structure)三級(jí)結(jié)構(gòu)(tertiary structure)四級(jí)結(jié)構(gòu)(quaternary structure),,高級(jí)結(jié)構(gòu)（空間構(gòu)象）,

2、conformation,5,蛋白質(zhì)分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)（primary）,牛胰島素一級(jí)結(jié)構(gòu)：A鏈（21AA)、B鏈（30AA),H2N-甘-異-纈-谷-谷胺-半-半-丙-絲-纈-半-絲-亮-酪-谷胺-亮-谷-天胺-酪-半-天胺-COOH,H2N-苯-纈-天胺-谷胺-絲-亮-半- 甘 - 絲 - 組 - 亮 - 纈 - 谷 -丙 -亮-酪-亮-纈-半-甘-谷

3、 -精-甘-苯-苯-酪-蘇-脯-賴-蘇-COOH,,,S,S,,,,A,B,蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)是空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，對(duì)其生物學(xué)功能起決定作用。,蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的排列順序。主要化學(xué)鍵為肽鍵，有些含二硫鍵。,Frederick Sanger,7,蛋白質(zhì)分子的二級(jí)結(jié)構(gòu) (secondary),——多肽鏈骨架中原子的局部空間排列，不涉及側(cè)鏈的構(gòu)象,多肽鏈骨架：由C?、羧基C和氨基N依次重復(fù)排列,多肽鏈的局部主鏈構(gòu)象,8,二級(jí)結(jié)構(gòu)

4、的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ) ——肽單元（peptide unit）,0.132,肽鍵中的四個(gè)原子（-CO-NH-）和與之相鄰的兩個(gè)α碳原子（C?1、 C?2）位于同一剛性平面內(nèi)，稱為肽單元。,,,,,,,10,?螺旋 (? helix) ?折疊 (? sheet) ?轉(zhuǎn)角 (? turn) 無(wú)規(guī)卷曲 (random coil),蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要形式,11,（1）多肽鏈主鏈圍繞中心軸螺旋式上升， 3.6個(gè)氨基酸殘基/圈，螺距

5、為0.54nm。（2）第1個(gè)肽單元羰基上的氧與第4個(gè)肽單元亞氨基上的氫形成氫鍵，方向與螺旋長(zhǎng)軸平行。（3）通常為右手螺旋。,?螺旋 （?? Helix ）,特點(diǎn),,13,13,鐵蛋白（ferritin）,跨膜蛋白,α螺旋分布廣泛,14,2.β折疊(β sheet),1）鋸齒狀, Cα為轉(zhuǎn)折點(diǎn),3）兩條或者更多的β折疊鏈間通過(guò)氫鍵相連,4） 不同鏈方向可以一致，可以相反,2）R基團(tuán)位于鋸齒結(jié)構(gòu)上、下方,Side view,,反平行,平

6、行,蠶絲蛋白,卵磷脂結(jié)合蛋白,17,3.? 轉(zhuǎn)角 (? turn),2) 一般由四個(gè)氨基酸殘基組成，第2或第3個(gè)殘基常為脯氨酸、甘氨酸3) 以主鏈間氫鍵維持穩(wěn)定（第1個(gè)殘基的羰基氧和第4個(gè)殘基的氨基氫）,1) 多肽鏈中180度回折處形成的特定構(gòu)象,17,? 轉(zhuǎn)角是α螺旋-α螺旋、β折疊-β折疊，或α螺旋-β折疊之間的連接。,沒(méi)有確定規(guī)律性的肽鏈結(jié)構(gòu)，柔性強(qiáng)的一類(lèi)二級(jí)結(jié)構(gòu),無(wú)規(guī)卷曲 (random coil),20,四種二級(jí)結(jié)構(gòu)可存在同

7、一個(gè)蛋白質(zhì)中,21,在許多蛋白質(zhì)分子中，可發(fā)現(xiàn)2個(gè)或2個(gè)以上具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的肽段，在空間上相互接近，形成一個(gè)規(guī)則的二級(jí)結(jié)構(gòu)組合，稱為超二級(jí)結(jié)構(gòu)或模體（motif）。,超二級(jí)結(jié)構(gòu),(supersecondary structure),αα,βαβ,ββ,Motifs,蛋白質(zhì)分子的三級(jí)結(jié)構(gòu) (tertiary),整條肽鏈中所有氨基酸殘基的相對(duì)空間位置，即一條多肽鏈中所有原子的整體空間排布，包括主鏈和側(cè)鏈。,23,Tertiary struc

8、ture of sperm whale（抹香鯨）myoglobin,24,蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),1、進(jìn)一步盤(pán)曲、折疊的多肽鏈分子長(zhǎng)度大大縮短， 呈棒 狀、纖維狀或球狀；2、三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性主要靠次級(jí)鍵維持，尤其是疏水鍵；3、側(cè)鏈基團(tuán)中的疏水基團(tuán)多位于分子內(nèi)部，親水基團(tuán)多位 于分子表面；4、有功能區(qū)的形成（分子表面或某些局部區(qū)域）。,只有一條肽鏈組成的蛋白質(zhì)，三級(jí)結(jié)構(gòu)是其最高的結(jié)構(gòu)形式。,維持蛋白質(zhì)分子構(gòu)象

9、的主要化學(xué)鍵,疏水作用,26,27,結(jié)構(gòu)域（domain）,多肽鏈的一部分，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，并具有獨(dú)立功能。,,,Structural domains in the polypeptide troponin C,（肌鈣蛋白）,28,有的蛋白質(zhì)分子包含多條肽鏈，它們彼此通過(guò)次級(jí)鍵相連，形成一定的空間結(jié)構(gòu)，稱為四級(jí)結(jié)構(gòu)。,具有獨(dú)立三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈單位，稱為亞基 (subunit).,蛋白質(zhì)分子的四級(jí)結(jié)構(gòu)（quarternary）,血紅蛋白四聚體,

10、蛋白質(zhì)的分類(lèi),1、按組成分類(lèi)：?jiǎn)渭兊鞍住⒔Y(jié)合蛋白 單純蛋白：只有氨基酸組分 結(jié)合蛋白：氨基酸組分＋其他組分（輔基）2、按形狀分類(lèi)：纖維狀蛋白、球狀蛋白 纖維狀蛋白：常為結(jié)構(gòu)蛋白 球狀蛋白：常為功能蛋白,29,S,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系The Relation of Structure and Function of Protein,第三節(jié),32,一級(jí)結(jié)構(gòu)是高級(jí)結(jié)構(gòu)以及生物學(xué)功能的基礎(chǔ),一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,,33,尿素或

11、β-巰基乙醇,去除尿素或β-巰基乙醇,天然構(gòu)象，有催化活性,非天然構(gòu)象，無(wú)催化活性,Normal Hemoglobin,Sickle Hemoglobin,鐮刀形紅細(xì)胞貧血,Sickle cell anemia,35,分子病（molecular disease）：由于基因突變引起蛋白質(zhì)分子發(fā)生變異所導(dǎo)致的疾病。,36,某些脊椎動(dòng)物胰島素一級(jí)結(jié)構(gòu)部分氨基酸殘基差異,,37,空間結(jié)構(gòu)體現(xiàn)生物活性；結(jié)構(gòu)相似，功能相似,空間結(jié)構(gòu)與功能

12、的關(guān)系,Myoglobin,Hemoglobin,肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白(Hb)的氧解離曲線,39,deoxy hemoglobin (T),oxy hemoglobin (R),Hb與O2 結(jié)合導(dǎo)致空間構(gòu)象變化,Tense state,Relaxed state,40,血紅素Fe2+與O2結(jié)合后，進(jìn)入血紅素平面，拉動(dòng)組氨酸殘基，從而拉動(dòng)F helix，最終改變分子構(gòu)象——?jiǎng)e構(gòu)效應(yīng),(allosteric effect),41,協(xié)

13、同效應(yīng)(cooperativity)：含多個(gè)亞基的蛋白質(zhì)，其中一個(gè)亞基與配體結(jié)合后，能影響其他亞基與配體的結(jié)合能力。,別構(gòu)效應(yīng)(allosteric effect)：蛋白質(zhì)分子的特定部位與小分子化合物結(jié)合后，蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而使其生物學(xué)活性發(fā)生變化。,正協(xié)同效應(yīng)(positive cooperativity)： 促進(jìn)作用負(fù)協(xié)同效應(yīng)(negative cooperativity)：

14、 抑制作用,42,蛋白質(zhì)構(gòu)象改變引起的疾病,老年癡呆 (Alzheimer’s disease) 瘋牛病 [Mad cow disease, or bovine spongiform encephalopathy or (BSE)] 亨汀頓舞蹈病 (Huntington’s disease),蛋白質(zhì)相互聚集，淀粉樣纖維沉淀,PrPc,PrPSc,瘋牛病發(fā)生機(jī)制,B. Prusiner "for his disc

15、overy of Prions - a new biological principle of infection".,朊蛋白（prion protein, PrP）,朊蛋白致病機(jī)理,S,第四節(jié),蛋白質(zhì)的理化性質(zhì),The Physical and Chemical Characters of Protein,46,一、蛋白質(zhì)的兩性解離（amphoteric）,在一定的pH條件下，蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘

16、基側(cè)鏈中的某些基團(tuán)，可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)。,蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)( isoelectric point, pI) 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時(shí)，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢(shì)相等，成為兼性離子，凈電荷為零，此時(shí)溶液的pH稱為pI。,47,蛋白質(zhì)分子含有酪氨酸和色氨酸殘基（共軛雙鍵），在280nm波長(zhǎng)處有特征性吸收峰。蛋白質(zhì)的OD280與其濃度呈正比關(guān)系，因此可作蛋白質(zhì)定量測(cè)定。,二、蛋白質(zhì)的紫外吸收,（ultraviolet abso

17、rption）,48,（1）茚三酮反應(yīng)(ninhydrin reaction) 蛋白質(zhì)水解后產(chǎn)生的氨基酸可發(fā)生茚三酮反應(yīng)。,（2）雙縮脲反應(yīng)(biuret reaction) 蛋白質(zhì)和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共 熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)，雙 縮脲反應(yīng)可用來(lái)蛋白質(zhì)定量。,三、蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng),肽鍵類(lèi)似于雙縮脲結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)膠體的穩(wěn)定因素1. 顆粒表面電荷；2.

18、 水化膜,四、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì),50,變性（denaturation）：在某些理化因素作用下，蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象破壞，導(dǎo)致其理化性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)的改變。,五、蛋白質(zhì)變性,Heat,,變性因素：1）物理因素：高溫、高壓、射線等2）化學(xué)因素：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬鹽等,變性后的表現(xiàn)：1）生物學(xué)活性喪失2）理化性質(zhì)改變：黏度增加，溶解度降低、 易被蛋白酶水解、結(jié)晶能力消失。,復(fù)性（renaturation）：蛋白質(zhì)變性程度較輕時(shí)，將變

19、性因素去除后，有些蛋白質(zhì)仍可恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能，稱為復(fù)性。,應(yīng)用①利用變性：酒精消毒，高壓滅菌，血濾液制備②防止變性：低溫保存生物制品（疫苗、抗體）③取代變性：乳品解毒(用于急救重金屬中毒),S,第五節(jié),蛋白質(zhì)的分離與純化,The Separation and Purification of Protein,54,一、透析和超濾 （根據(jù)分子量）,透析 (dialysis)利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物

20、分開(kāi)的方法。,超濾 (ultrafiltration)應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過(guò)超濾膜，小分子濾出，大分子留在膜內(nèi)。,54,55,二、沉淀(precipitation),丙酮、乙醇等有機(jī)溶劑，可破壞蛋白質(zhì)的水化膜，在0～4℃低溫下，使蛋白質(zhì)沉淀。環(huán)境溫度高時(shí)，有機(jī)溶劑可促使蛋白質(zhì)變性。,酒精消毒是使蛋白質(zhì)變性還是沉淀？,鹽析(salt precipitation)：將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和

21、以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。,56,蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場(chǎng)中能向正極或負(fù)極移動(dòng)。這種通過(guò)蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中泳動(dòng)而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù), 稱為電泳。,三、電泳 (electrophoresis),57,四、層析（chromatography）,例如：凝膠過(guò)濾（gel filtration，分子篩）： 根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同來(lái)分離,58,五、超速離心（ultracentrifuga

22、tion）,根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量與形狀分離,蛋白質(zhì)在離心場(chǎng)中的行為用沉降系數(shù)(sedimentation coefficient, S) 表示，沉降系數(shù)的大小與蛋白質(zhì)的密度和形狀相關(guān)，大體上和分子量成正比關(guān)系。,超速離心,本章重點(diǎn)1、重要名詞：isoelectric point；motif；domain; subunit； allosteric effect; protein denaturation; molecula

23、r disease2、結(jié)構(gòu)層次 元素組成：C、H、O、N（16%）、S 結(jié)構(gòu)單位：20種L-α氨基酸（芳香族、含硫、酸性、堿性氨基酸等） 一級(jí)結(jié)構(gòu)：肽鍵；多肽鏈；N端?C端 二級(jí)結(jié)構(gòu)：穩(wěn)定力（氫鍵）；類(lèi)型（?螺旋，?折疊，?轉(zhuǎn)角，無(wú)規(guī)卷曲） 三級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 四級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)3、結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系（舉例）4、重要性質(zhì)：兩性解離；紫外吸收；沉淀；變性5、分離純化：透析、超濾；沉淀；電泳；層析；超速離心,61,1. 具有四級(jí)結(jié)構(gòu)

24、的蛋白質(zhì)分子，在分析其一級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn) 只有1個(gè)N端和1個(gè)C端 　 具有1個(gè)N端和多個(gè)C端 具有多個(gè)N端和1個(gè)C端 　 具有多個(gè)N端和多個(gè)C端 有磷酸二酯鍵存在,答案：D考點(diǎn)：蛋白質(zhì)的各級(jí)結(jié)構(gòu)；多肽鏈的方向性； 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)主要化學(xué)鍵,測(cè)一測(cè),62,2. 有一蛋白質(zhì)混合溶液,各種蛋白質(zhì)的pI 分別為4.6、5.0、5.3、6.7、7.3。電泳時(shí)欲使其中4種泳向正極, 緩沖液的pH 應(yīng)該

25、是 A. 5.0 B. 4.6 C. 6.7 D. 7.0 E. 8.0,答案：D考點(diǎn)：等電點(diǎn)的概念；電泳原理,測(cè)一測(cè),63,3. 將下列蛋白質(zhì)混合樣品進(jìn)行凝膠過(guò)濾，最先被洗脫的是 牛胰島素 (分子量5 700) 肌紅蛋白 (分子量16 900)C. 牛?-乳球蛋白 (分子量35 000) D. 血清清蛋白 (分子