流式細(xì)胞基本知識(shí)

1、1、流式細(xì)胞儀上的、流式細(xì)胞儀上的FL2WFL2AFL2H分別是做什么的？分別是做什么的？FL2W是只檢測(cè)熒光的脈沖寬度，F(xiàn)L2H是指脈沖高度。通常在做細(xì)胞周期分析時(shí)應(yīng)用，用于去除粘連細(xì)胞。2、流式同型對(duì)照怎樣選擇？、流式同型對(duì)照怎樣選擇？同型對(duì)照（IsotypeControl）：使用與一抗相同種屬來源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面而產(chǎn)生的背景染色。如果一抗是多抗，可以用

2、annmalserum（與一抗相同的正常血清）（mustbethesamespeciesasprimaryantibody）。Thiscontroliseasytoachievecanbeusedroutinelyinimmunohistochemicalstaining.這個(gè)可以咨詢?cè)噭┥?。同型?duì)照為免疫熒光標(biāo)記中的陰性對(duì)照。由于熒光標(biāo)記單抗的組來源不同，應(yīng)選用相同來源的未標(biāo)記單抗作為同型對(duì)照來調(diào)整背景染色。舉個(gè)例子：比如檢測(cè)一抗為單

3、抗的mouseantiratCD11b，cloneOX42purifiedIgG，那么它的isotype是mouseIgG2a，所以可以用purified（純化的）mouseIgG2a來做OX42的同型對(duì)照（IsotypeControl）。一般的的生物技術(shù)公司和國(guó)內(nèi)的代理都有出售。同型對(duì)照：是指與MoAb相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亞類，若使用直接免疫熒光染色法，同型對(duì)照也應(yīng)標(biāo)記熒光色素，如IgG1FITC、IgG2ａ、PE等。主要考

4、慮了細(xì)胞的自發(fā)熒光、FC受體介導(dǎo)的抗體結(jié)合和非特異性抗體結(jié)合等影響因素。此外，同型對(duì)照與MoAb所標(biāo)記的熒光色素、濃度、F：P比值（標(biāo)記的熒光色素與免疫球蛋白分子的比值）應(yīng)該相同為最佳，這對(duì)準(zhǔn)確設(shè)定陰性與陽性細(xì)胞的界標(biāo)有重要意義，切忌使用與MoAb不相匹配的同型對(duì)照，最好為同一實(shí)驗(yàn)室、采用相同工藝或方法制備（如同一品牌）的產(chǎn)品。3、流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度為何要使用氯化鈣、流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度為何要使用氯化鈣.在文獻(xiàn)

5、及其他專業(yè)網(wǎng)站中都有在文獻(xiàn)及其他專業(yè)網(wǎng)站中都有測(cè)定游離鈣的方法，具體如下：測(cè)定游離鈣的方法，具體如下：（1）鈣熒光探針負(fù)載；（2）隨機(jī)測(cè)定每管細(xì)胞懸液樣品（以下簡(jiǎn)稱樣品）的單個(gè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，記為F值。（3）加入10%TritonX100，（破膜用）；加入1mmolL氯化鈣，（問題所在），吹打均勻，孵育1~10min，測(cè)定熒光即Fmax值。（4）加入EGTA，20μl（鈣螯合劑），孵育1~10min，激發(fā)波長(zhǎng)488nm測(cè)定熒光，即Fmi

6、n值。這個(gè)過程中的氯化鈣的作用如何，請(qǐng)高人指點(diǎn)，謝謝。因?yàn)檎Ｑ獫{中Ca2＋濃度是1mM，細(xì)胞外液的Ca2＋對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2＋有影響。加0.1%triton是增加膜通透性，使細(xì)胞外Ca2＋進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，作為最大值。加EGTA是為了螯合Ca2＋，作為最小值.生理環(huán)境中細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度遠(yuǎn)低于細(xì)胞外液（大約1：10000），細(xì)胞膜對(duì)鈣的通透性變化對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣影響很大。8、流式技術(shù)中的、流式技術(shù)中的APC，pure標(biāo)記是什么意思呢標(biāo)記是什么意思呢?zé)晒?/p>

7、物質(zhì)通常是指那些在受到一個(gè)波長(zhǎng)激發(fā)后，處于一個(gè)能量不穩(wěn)定的狀態(tài)，能發(fā)射一個(gè)波長(zhǎng)比激發(fā)波長(zhǎng)長(zhǎng)的光的一類物質(zhì)。當(dāng)然熒光并不都是受激發(fā)后發(fā)射的，如一些生物可以發(fā)射熒光，如熒火蟲，發(fā)光細(xì)菌等，他們發(fā)出的光是通過體內(nèi)的酶促反應(yīng)而產(chǎn)生的，這個(gè)酶通常被稱為熒光素酶.EB是一種熒光物質(zhì)，它在受到紫外線照射后可以發(fā)出一可見光，常用于DNA、RNA電泳中。APC英文全名：allophycocyanin；中文名：別藻青蛋白；最大吸收峰：650nm，最大發(fā)射熒

8、光峰：660nm，適用于雙激光流式儀，可被600640nm波長(zhǎng)的激光激發(fā)。PerCP英文全名：peridininchlophyllprotein，中文名：多甲藻葉綠素蛋白；最大激發(fā)波峰490nm，被488nm的氬離子激光激發(fā)后，發(fā)射光峰值約為677nm，與FITC、PE進(jìn)行多色熒光染色補(bǔ)償重疊較少，非特異性結(jié)合也較少。雖然較易使用，但量子產(chǎn)量不高，多用于檢測(cè)表達(dá)較高的抗原。9、怎樣用流式細(xì)胞儀來鑒定小鼠、怎樣用流式細(xì)胞儀來鑒定小鼠BMD

9、C？檢測(cè)小鼠BMDC主要是從形態(tài)學(xué)和細(xì)胞表面分子兩方面來鑒定我做的時(shí)候就做了普通光鏡下形態(tài)、電鏡（掃描和透射），另外檢測(cè)了小鼠BMDC表面的共刺激分子如CD86、CD11、CD80。還做了MHCII類分子的檢測(cè)，還有MHCI類分子的檢測(cè)，這些分子在DC表面都不是特異存在的，在巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞表面也有表達(dá)，所以目前并沒有非常特異性的方法檢測(cè)你的細(xì)胞一定就是DC，但是從形態(tài)和表面分子的檢測(cè)結(jié)合來看，效果就比較好了.一般在幼稚的DC上述分子

10、表達(dá)水平較低，DC成熟過程中，上述分子表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì)，你可以在不同的培養(yǎng)時(shí)間分別檢測(cè)。10、請(qǐng)問流式細(xì)胞術(shù)單抗直接熒光需要幾種對(duì)照？、請(qǐng)問流式細(xì)胞術(shù)單抗直接熒光需要幾種對(duì)照？首先確認(rèn)你用的直標(biāo)抗體的熒光染料是什么，再確定該抗體的來源種屬，選擇相應(yīng)的同型對(duì)照。如：你現(xiàn)在想檢測(cè)小鼠淋巴細(xì)胞表面的CD4抗原，熒光染料為FITC，抗體來源為大鼠的IgG1亞型，即RatantiMouseCD4FITC（IgG1），你所需要的同型對(duì)照就應(yīng)該是Rat

11、IgG1FITC，一般的抗體說明上都會(huì)寫清。11、6孔板的細(xì)胞量能否做流式呀？孔板的細(xì)胞量能否做流式呀？對(duì)于6孔板而言，每孔的表面積為10cm2，依細(xì)胞種類不同在長(zhǎng)滿時(shí)達(dá)到的數(shù)量從510的5次方到510的6次方不等。6孔板絕對(duì)沒問題的！甚至24孔板也可以正常做。不過用于調(diào)試儀器參數(shù)的正常細(xì)胞要多準(zhǔn)備一些。12、血液里的、血液里的mononuclearcell（除外紅細(xì)胞，血小板和破碎的細(xì)胞碎片）（除外紅細(xì)胞，血小板和破碎的細(xì)胞碎片），能