bacillussp.bsd8肌酸水解酶基因的克隆、表達和酶性質(zhì)的研究

1、浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院碩士學(xué)位論文Bacillus sp.BSD-8肌酸水解酶基因的克隆、表達和酶性質(zhì)的研究姓名：盧紅波申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：馬曉航20080501浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要肌酸水解酶( E C3 ．5 ．3 ．3 ) 是肌氨酸氧化酶法測定肌酐含量方法中的關(guān)鍵酶，與肌酐水解酶和肌氨酸氧化酶催化肌酐的降解。肌酸水解酶的降解性能的好壞直接影響到酶法測定在臨床應(yīng)用中的推廣。雖然人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多可以產(chǎn)生肌酸水解

2、酶的細菌，但對該酶的性質(zhì)研究較少。B a c i l l u ss p ．B S D - 8 菌株是由本實驗室從土壤中篩選出的細菌，能夠以肌酐作為唯一氮源生長，但在細菌發(fā)酵過程中卻檢測不到肌酸水解酶。本論文由肌酸水解酶的克隆入手，通過分子生物學(xué)方法進行基因克隆，構(gòu)建肌酸水解酶重組表達菌株，通過誘導(dǎo)表達和純化，獲得重組酶，進而研究該菌株肌酸水解酶性質(zhì)。本論文的主要研究成果如下：( 1 ) J A B a c i l l u ss p ．B

3、 S D ．8 菌株中克隆肌酸水解酶基因并測序，得到1 2 3 6 b p的片段( a c c e s s i o n n o ．E U 5 4 6 2 2 6 ) ，編碼4 1 1 氨基酸殘基序列。序列分析發(fā)現(xiàn)肌酸水解酶基因的調(diào)控序列．1 0 區(qū)、．3 5 區(qū)、S D 序列和終止予后的反向互補序列。( 2 ) 成功進行基因克隆，與質(zhì)粒p E T 0 2 8 a ( + ) 連接，構(gòu)建肌酸水解酶重組質(zhì)粒p E T - 2 8 a - C

4、 R E ，分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌B L 2 1 ( D E 3 ) 、B L 2 1 ( D E 3 ) p L y s S ，并在I P T G誘導(dǎo)下高效表達。( 3 ) 對重組酶進行N i ．I D A H i s ．B a n d 親和柱純化，獲得了高濃度高純度的酶液。純化后的肌酸水解酶比活為9 ．9 4 U ／m g ，在S D S ．P A G E 中顯示為單一條帶。( 4 ) 研究重組酶的各項性質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：酶的最適p H 值為

5、7 ．5 ，在p H 5到8 的范圍處理2 4 h 后殘余酶活力均在8 0 ％以上；酶的最適反應(yīng)溫度為3 7 ℃，在p H 7 ．5 的磷酸鹽緩沖液中不同溫度處理3 0 m i n 后，測定殘余酶活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組酶在4 5 ℃以下穩(wěn)定；酶的動力學(xué)常數(shù)K m 是2 0 ．4 9 m M ，k c a t 約為1 2 ．2 ／s ao 。5 ％的S D S ，l m M c u 2 + ，H 9 2 + 和A 礦對酶活具有完全抑制作用，所