pfcp2.9瘧疾疫苗候選抗原系列突變體的構(gòu)建及其表位和免疫學(xué)分析

1、第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文PfCP-2.9瘧疾疫苗候選抗原系列突變體的構(gòu)建及其表位和免疫學(xué)分析姓名：李長(zhǎng)嶺申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：病原生物學(xué)指導(dǎo)教師：潘衛(wèi)慶;張冬梅20100501第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文和功能，包括識(shí)別線性表位或構(gòu)象表位、具有抑制瘧原蟲(chóng)入侵或阻遏該抑制作用等。采用W e s t e r nB l o t 和E L I S A 方法，通過(guò)檢測(cè)各單抗與各P f C P ．2 ．9 突變體的結(jié)合反應(yīng)，分析這些單抗識(shí)別的表位及其

2、分布。結(jié)果顯示：( 1 ) 一株抑制性單抗m A b 7 G 識(shí)別的表位與三個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變( M 6 2 ：P h e 4 9 l - ) A l a ，M 8 2 ：G l u 5 l l - - > G i n 和M 8 4 ：A r g ”3 - - > L y s ) 相關(guān)，這三個(gè)位點(diǎn)均位于A M A ．1 ( I I I ) 的C 末端非結(jié)構(gòu)區(qū)( U n s t r u c t u r e dr e g i o

3、n ) 的分子表面，在空間構(gòu)象上彼此靠近，并且其中的任何一個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變都會(huì)使m A b 7 G 的識(shí)別明顯減弱。( 2 ) M 6 2 和M 8 2 的突變還致使單抗m A b l 1 ．1 2 的結(jié)合發(fā)生減弱；M 6 2 使單抗m A b W 9 ．1 0 的結(jié)合減弱。這些結(jié)果提示，m A b l l ．1 2 ( P h e 4 9 1 和G l u 5 1 1 ) 和m A b W 9 ．1 0 ( P h e 叫1 ) 有可能

4、通過(guò)結(jié)合位點(diǎn)的相互競(jìng)爭(zhēng)而阻斷m A b 7 G 抗體的抑制活性；( 3 ) 在針對(duì)P f M S P l ．1 9 組分的突變體設(shè)計(jì)中，有四個(gè)突變體是針對(duì)M S P l ．1 9 阻遏性表位的突變，這些突變所在的位點(diǎn)分別是A s n l 5 ，O l u 2 7 ，L e u 3 1 和G l u 4 3 ，文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果表明，這四個(gè)位點(diǎn)的突變可以阻斷四個(gè)阻遏性單抗( m A b 7 ．5 ．m A b 2 ．2 ，m A b l E l

5、 和m A b l l l ．4 ) 與P f M S P l ．1 9 結(jié)合。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采用W e s t e r nB l o t 和E L I S A 方法均證實(shí)，阻遏性單抗m A b l E l 與P f C P - 2 ．9 上述位點(diǎn)的突變體結(jié)合與P f l V I S P I 一1 9 結(jié)果一致；( 4 ) M 1 6 0 突變導(dǎo)致對(duì)多數(shù)單抗的結(jié)合發(fā)生改變，表明該位點(diǎn)( A s n ”) 可能在P f C P ．2 ．

6、9 分子的折疊和維持構(gòu)象中發(fā)揮重要作用。為分析瘧疾病人免疫血清與P f C P ．2 ．9 及其突變體的結(jié)合反應(yīng)，我們收集了9 6 份惡性瘧疾病人的血清，采用E L I S A 方法檢測(cè)這些血清樣本對(duì)P f C P ．2 ．9 的識(shí)別情況。結(jié)果顯示，其中9 1 份血清識(shí)別P f C P ．2 ．9 ，陽(yáng)性率9 4 ．8 ％，表明在自然感染情況下，能產(chǎn)生針對(duì)P f C P ．2 ．9 疫苗抗原的特異抗體。在此基礎(chǔ)上，我們選取其中7 4 份

7、陽(yáng)性血清樣本，比較它們與P f C P - 2 ．9 及其突變體的結(jié)合差異。結(jié)果顯示，現(xiàn)場(chǎng)血清可以與大部分P f C P ．2 ．9 的突變體正常結(jié)合。但在P f M S P l ．1 9 組分上的突變體與血清結(jié)合發(fā)生了明顯的改變，特別是突變其阻遏性表位的突變體( M 1 6 0 、M 1 7 2 、M 1 7 6 和M 1 8 8 ) ，這可能緣于病人血清中存在較高水平的阻遏性抗體。這些結(jié)果為今后設(shè)計(jì)排除阻遏性表位的疫苗提供了依據(jù)。為

8、了解P f C P - 2 ．9 突變體的免疫原性及其免疫血清體外抑制瘧原蟲(chóng)生長(zhǎng)的效力是否發(fā)生改變，我們將P f C P - 2 ．9 及其三個(gè)突變阻遏性表位的突變體進(jìn)行發(fā)酵和蛋白純化，獲得的重組蛋白進(jìn)行平行新西蘭兔免疫實(shí)驗(yàn)。免疫血清分析結(jié)果表明，P f C P - 2 ．9與其突變體的免疫原性，即抗體水平，無(wú)顯著差異( p > 0 ．0 5 ) 。我們分離了免疫兔血清中的總I g G 并進(jìn)行體外抑制試驗(yàn)。結(jié)果表明，P f C P