解淀粉芽孢桿菌SWB16脂肽類代謝產(chǎn)物對球孢白僵菌的拮抗作用及發(fā)酵條件的初步優(yōu)化.pdf

1、芽孢桿菌作為一類非常重要的生防微生物資源，已用其開發(fā)出了眾多的微生物殺菌制劑。但是目前的制劑產(chǎn)品僅僅以芽孢的數(shù)量作為質(zhì)量評價指標(biāo)，在制劑的加工過程中，多數(shù)的廠家會將發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行濃縮干燥，然后加入到制劑中，并沒有對抑菌活性物質(zhì)的種類進(jìn)行定性定量分析。芽孢桿菌類生防菌通過多種抑菌機(jī)理達(dá)到抑菌作用，包括競爭作用、溶菌作用、拮抗作用、誘導(dǎo)植物抗性等，并且因菌株和發(fā)酵條件不同，抑菌活性物質(zhì)的種類和含量也會有較大的差異，所以這類微生物

2、農(nóng)藥的質(zhì)量不能僅僅通過芽孢數(shù)量來進(jìn)行準(zhǔn)確評價，只有同時對制劑產(chǎn)品所含的芽孢數(shù)量和抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析，才能對這類微生物農(nóng)藥的質(zhì)量進(jìn)行準(zhǔn)確全面地評價。
　　本論文選取植物內(nèi)生菌解淀粉芽孢桿菌SWB16，對其進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室之前的研究成果，采用特定的針對脂肽抗生素的分離提取辦法，對得到的解淀粉芽孢桿菌SWB16發(fā)酵液上清液進(jìn)行處理，得到發(fā)酵產(chǎn)物的甲醇提取液。針對得到的發(fā)酵產(chǎn)物粗提物進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)研究:
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3、利用本實(shí)驗(yàn)室分離得到的一株球孢白僵菌，對得到的發(fā)酵產(chǎn)物甲醇提取液進(jìn)行活性檢測，通過拮抗試驗(yàn)，研究了活性產(chǎn)物對球孢白僵菌孢子萌發(fā)以及菌絲生長的抑制作用，在其作用下可使球孢白僵菌孢子失去萌發(fā)能力或是使孢子直接破裂、使球孢白僵菌菌絲消融、變細(xì)，原生質(zhì)體外漏，菌絲體扭曲變形，形成泡囊結(jié)構(gòu)等;同時研究表明活性產(chǎn)物對溫度、紫外線、蛋白酶K等都具有良好的耐受性且是菌株SWB16發(fā)酵液中抑制球孢白僵菌生長的主要成分。
　?。ǘ┩ㄟ^利用HPLC、

4、LC-MS技術(shù)對得到的活性粗提物進(jìn)行定量定性分析，將得到的活性產(chǎn)物各組分分子質(zhì)量與脂肽抗生素各種類理論相對分子質(zhì)量相對比，同時結(jié)合之前實(shí)驗(yàn)中觀察到的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)，活性提取物中含有Iturins、Fengycins和Surfactins三大類脂肽抗生素。其中，Iturins類含有C14-IturinA、C15-IturinA、C16-IturinA、C17-IturinA四種;Fengycins類含有的種類僅通過LC-MS技術(shù)不能確定，

5、很可能同時含有C15-FengycinA、C16-FengycinA、C17-FengycinA、C18-FengycinA和C14-FengycinB、C15-FengycinB、C16-FengycinB、C17-FengycinB這兩類同系物;而Surfactins可能含有的種類包括C13-SurfactinA、C14-SurfactinA、C15-SurfactinA和 C14-SurfactinB、 C15-Surfactin

6、B、 C16-SurfactinB以及C13-SurfactinC、C14-SurfactinC、C15-SurfactinC這三類同系物?？偟倪@三大類脂肽抗生素占粗提物的相對質(zhì)量達(dá)到了77.216％。
　?。ㄈ┩ㄟ^單因素實(shí)驗(yàn)方法對菌株SWB16的發(fā)酵條件進(jìn)行初步優(yōu)化，初步確定SWB16的最佳發(fā)酵條件是初始pH7.0、接種量5％、發(fā)酵培養(yǎng)溫度30℃、發(fā)酵時間36h、裝液量60ml（250ml三角瓶）、搖床轉(zhuǎn)速為190rpm，脂肽