gdnf對大鼠腦缺血／再灌注損傷的治療時間窗與caspase-3表達(dá)的關(guān)系

1、中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報 JC h i nM e dU n i v 第 3 3 卷 第 4 期 2 0 0 4年 8 月· 3 1 7·G D N F 對大 鼠腦缺血／ 再灌注損傷的治療 時間窗與 c a s p a s e 一 3 表達(dá)的關(guān)系張榮偉 ， 王慕一 ( 中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院干診科。 遼寧 沈陽11 0 0 0 1 )【 摘要】目的： 探討膠質(zhì)細(xì) 胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因 子( G D N F ) 對大鼠腦缺血再灌注

2、 損傷的殆療時間窗與半胱天冬酶3 ( c a s p a s e - 3 ) 蛋 白表達(dá)的關(guān)系。方法： 建立大鼠大腦中動脈閉塞2h 模型， 再灌注0 ， l ， 3h 分別給予 G D N F ， 觀察 再灌注 1 0h 及 2 2h 缺血半暗帶 c a s p a s e - 3 蛋 白 表達(dá)。r r c染色測定梗死灶體積。結(jié)果： lh 給藥組腦梗死灶體積較 0h 給藥組增大， c a s p a s e - 3 蛋白表達(dá)增加 ( P

3、< 0 ． 0 5 ) 。 3h 給藥組腦梗死灶體積較lh 給藥組增大， c a s p a s e - 3 蛋白表 達(dá)增加 ( P<0 ． 0 5 ) 。 0h 及 lh 給藥組再灌注2 2h 較 1 0hc a s p a s e ． 3 蛋 白表達(dá)減少， 3h 給藥組再灌注 2 2h 較 1 0hc a s p s s e - 3 蛋 白 表達(dá)增加 ( P<0 ． 0 5 ) 。 結(jié)論 ： G D N F 對缺血

4、豐暗帶c a s p a s e - 3 蛋 白表達(dá)與治療時間窗有關(guān)， G D N F可通 過減少 c s s p a s e - 3的表達(dá)減少腦缺 再灌注損傷細(xì)胞凋亡的發(fā)生。一【 關(guān)鍵詞】膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因 子； 腦缺再灌注損傷； 時間窗； 豐胱天冬酶3【 中固分類號】R 3 6 4 ． 1【 文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A【 文章編號】 0 2 5 8 — 4 6 4 6 ( 2 0 0 4 ) 0 4 — 0 3 1 7 — 0 2Re l

5、a t i o n s h i pb e t we e nt h e r a p e u t i ct i mewi n d o w o fGDNF f o rc e r e b r a li s c h e m l a ／ r e p e r f u s i o ni n j u r yo fr a t sa n de x p r e s s i o no fc a s p a s e - 3Z H A N GR o n g —

6、w e i ， WAN GMu — y i( D e p a r t m e n to fG e r i a t r i c s ， T h eF i r s tA f i l i a t e dH o s p i t a l ， C h i n aM e d i c a lU n i v e r s i t y 。 s h ea n g1 1 0 0 0 1 ， C h i n a )【 A b s t r a c t ]O b j

7、e c t i v e ： T od i s c u s st h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h et h e r a p e u t i ct i m ew i n d o wo f0 i a lc e l ll i n e — d e r i v e dn e u r o t r o p h i cf a c t o r ( G D N F )f o rc e r e b r a

8、li s c h e m i a ／ r e p e r f u s i o ni n j u r yo fr a t sa n de x p r e s s i o no fc y s t e i n y la s p a r a t e - s p e c i f i cp r o t e i n a s e - 3( c ~ p a s e 3)p r o t e i n ． Me t h o d s ： B a tm o d e

9、 lo ft r a n s i e n tf o c a lc e r e b r a li s c h e m i aw a sm a d eb y2 · h o u ro c c l u s i o no f t h em i d l ec er e b r a la r t e r y ． T h eGD N Fw a sa d m i n i s t r a t e d0。 1 ， 3h o u r sa f t e

10、 rr e p e r f u s i o n ．Weo b s e r v e dt h ee x p r e s s i o no fc a s p a s e - 3p r o t e i n1 0a n d2 2h o u r sa f t e rr ep e r f u s i o n ． I n f a r c ts i z ew a sc a l c ~a t e db yu s i n g 下I ℃ s t a i n

11、i n gm e ~o d ．R e s u l t s ： I n -f a r c tv o l u m ea nde x p r e s s i o no fc a s p a s e - 3p r o t e i ni n1 - h o u rg r o u pw e r eg r e a t e rt h a n t h o s ei n0 - h o u rg r o u p( P <0 ． 0 5 ) ．T h o

12、 s ei n3 - h o u rg r o u pw e r eg r e a t e rt h a nt h o s ei n1 - h o u rg r o u p ( P <0 ． 0 5 ) ． T h ee x p r e s s i o no fc a s p a s e - 3p r o t e i n2 2h o u r sa f t e rr ep e r f u s i o nw a sl e s st h

13、 a nt h a t1 0h o u r sa f t e rr ep e d u s i o ni n0 - a nd1 7 h o u r g r o u p ， H o w e v e r ， t h ee x p r es s i o nw a sg r e t e ri n3 - h o u rg r o u p2 2h o u r sa f t e rr e p e r f u s i o nt h a nt h a t

14、1 0h o u r sr e p e r f u s i o n ( P <0 ． 0 5 ) ，C o n d u s i o n ： T h ee f e c to fG D N Fo nt h ee x p r e s s i o no f c a s p a s e - 3i np e n u mb r ai sr el a t e d tw i t ht h et h e r a p e u t i ct i mew

15、 i n d o w ．T h eG D N Fc a nr e d u c e t h ei n c i d e n c e o fn e u r o n a la p o p t m i sd u r i n gt h ec er e b r a li s c h e m i ar e p e r f u s i o ni n j u r yb yr e d u c i n gt h ee x p r e s s i o no f

16、c a s p a s e - 3p r o t e i n ．【 K e yw o r d s 】g l i a lc e l li l n e · d e r i v e dn e u r o t r o p h i cf a c t o r ；c e r e b r a li s c h e m i ar e p e r f u s i o ni n j u r y ； t i m ew i n d o w ；c y s

17、 t e i n y la s p a r a t e · s p e c i f i cp r o t e i n a s e - 3腦缺血再灌注中發(fā)現(xiàn)， 再灌注階段的損傷 占 整 個損傷的7 0 ％以上?。既往認(rèn)為 自由基代謝異常是這種損害的重要原因， 研究表明， 細(xì)胞凋亡可能參 與了 腦缺血／ 再灌注神經(jīng)細(xì)胞損傷【 2 】 。 膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(a lc e l ll i n e — d e r i v e dn

18、 e u r o t r o p h i cf a c t o r ， G D N F ) 對大鼠 腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用毋庸質(zhì)疑， 然而不同治療時間窗下其與半胱天冬酶3( c y s t e i n y la s p a r a t e - s p e c i f i cp r o t e i n a s e3 ， c a s p a s e - 3 ) 表 達(dá)的關(guān)系少有報道， 本文就此作一探討。【 收■日 期】 2 0 0 3

19、一 ∞ 一 0 51 材料與方法 I ， I 實驗動物與分組 選擇體重為2 7 0 — 3 2 0g 的成年雄性 W i s t a r 大鼠， 由沈陽市藥品檢驗所提供。隨機(jī)分為 2組： 腦梗死體積組( V) 及免疫組化組 ( I ) 。每組再各分 2 組： I 組： 缺血 2h 再灌 1 0h組 ， Ⅱ 組 ： 缺血 2h 再灌 2 2h組。 I 及 Ⅱ組按再灌 注0 ， 1 ， 3h 給藥時間不同分 3 個亞組， 每組 5 只大 鼠

20、， 假手術(shù)組 3只。1 ， 2 局灶腦缺血模型及給藥方法 Z e aL o n g a 線栓 維普資訊 http://www.cqvip.com 第4期 袁鳳山等 ． 人胰島素原基因胰外表達(dá)重組體的構(gòu)建及鑒定 · 3 2 3·3 討論 基因治療糖尿病 目 前存在 的兩個主要問題 ， 即：使胰島素原基因在非 1 3 細(xì)胞 表達(dá)成熟島素 ， 選擇安 全有效的載體 系統(tǒng)。本實驗采用 了簡捷的 P C R定 點突變技術(shù)

21、， 將人胰島素原基因 c D N A上 B ． C鏈連 接處的堿基序列 L y sT h rA r gA r g 及 C — A鏈連接處 的L e uG i nL y sA r g 分別突變?yōu)?A r gT h rL y sA r g 及 A r gG i nL y sA r g 序列。突變后 的序列可被存在 于大 部分細(xì)胞的內(nèi)肽酶f u r i n 識別和剪切， 因而修飾的胰 島素原基因在大部分非 細(xì)胞也可合成和分泌成 熟胰島素。逆轉(zhuǎn)

22、錄病毒載體是真核細(xì)胞載體穿梭載體的一 種 ， 其介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移有許多的優(yōu)勢 ： 含有 目的基 因的病毒載體可感染多種細(xì)胞 ， 可廣泛用于體外實驗 和動物實驗 ； 逆轉(zhuǎn)錄病毒 的 R N A基 因的 D N A拷 貝可穩(wěn)定整合進(jìn)被感染細(xì)胞的染色體中， 而宿主細(xì)胞 通常不受損害， 并隨細(xì)胞的分裂傳遞給子代； 載體一旦整合到宿主細(xì)胞就可長期表達(dá)。本實驗利用逆轉(zhuǎn) 錄病毒的這些優(yōu)點重組 了 p L X S N — I n s 。遠(yuǎn)優(yōu)于腺病 毒等載

23、體受細(xì)胞類型的限制， 生存期短， 需要重復(fù)注 射易產(chǎn)生免疫力 等缺點。p L X S N載體不僅 去除 了g a g ， p o l ， e n v 等病毒結(jié)構(gòu)基 因， 且將 g a g基因的起始 密碼子 A T G變成終止密碼子 T A G， 將 5端序列用相 應(yīng)的小 鼠肉瘤病毒序列 取代 ， 進(jìn)一步 降低 了同源重 ( 上接第 3 1 8 頁 )鼠短暫全腦缺血后海馬 C A 1 區(qū)錐體細(xì)胞持續(xù)表達(dá) c a s p a s e - 3

24、m R N A， 缺血 2 4h 后較 明顯 ， 且高水平至少 持續(xù) 7 2hJ 。還 有作者發(fā)現(xiàn) ， c a s p a s e - 3P 3 2 免疫反 應(yīng)物在腦缺血后神經(jīng)元中表 達(dá)， 尤其在皮質(zhì)梨狀神 經(jīng)元核周 ， 且在再灌后 1 ～1 2 h 后表達(dá)明顯。本研究 發(fā)現(xiàn) G D N F 減輕再灌注損傷的作用與減輕缺血半暗 帶 c a s p a s e - 3蛋 白表 達(dá)有關(guān) 。神經(jīng)保 護(hù)的主要 目的是干預(yù)半暗帶發(fā)生 的病理生 化

25、級聯(lián)反應(yīng) ， 阻止或延 遲細(xì)胞死亡。不同神經(jīng)保護(hù)劑有其不同的可能作用模式 ， 不同的應(yīng)用時間窗可能有不同的效果?！?參考文獻(xiàn)】[ 1 ]A m o w a k iJ ， S t r o n g R ， G r o t t aJ C ． R e p e r f u s i o n i n j u r yd e m o n s t a t i o no fb r a i nda g ep r o d u c e db yr e p e r

26、f u s i o na f t e rt r a n s i e n tf o c a li s c h e mi ai nr a t s [ J ] ． JC e r e bF l o wM e t a b ， 1 9 9 7 ， 1 7 ( 1 0 ) ： 1 0 4 8— 1 0 5 0 ．【 2 ]S c h u l zJ B ， W e l e rM． M o s k o w i t zM A ． C e s p a s e

27、a st r e m t m e n tt a rt si n組 ， 有較高安全性。重組體 p L X S N ． I n s 經(jīng) 體外 轉(zhuǎn)染 肝癌細(xì)胞證實， 載體 p L X S N已將修飾的胰島素原基 因成功整合到宿主細(xì)胞基因組， 其細(xì)胞外液已穩(wěn)定表達(dá)較高濃度成熟胰島素 本實驗完成 了人胰 島素原基 因二次突變 ， 并克 隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 ， 體外 轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞檢測到成 熟胰島素的分泌。為基因治療糖尿病進(jìn)一步應(yīng)用于 動物實驗及建立

28、調(diào)控分泌成熟胰島素的非細(xì)胞系奠 定了基礎(chǔ)。【 參考文 獻(xiàn)】[ 1 ]B l om ~ u d e nZ T ．A m e r i c a nD i a b e t e sA s s oi a t i o nA n n u a lM e e t i n g ．1 9 9 9 ．N e wa p p r o a c h e st oi n s u l i nt r e a ~ n ta n dg l u o~m o n i t o r i

29、n g[ J ] ．D i a b e t e sC a r e ， 1 9 9 9 ， 2 2 ( 1 2 )： 2 0 7 8 — 2 0 8 2 ．[ 2 ]I t a l b a nP A ， l ( a } I nS E ， L e n m m r kA． 吐a 1 ． O e n ea ndc e l lr e p l a r ~ e -m e n tt h e r a p yi nt h et r e a t m e n

30、to ft y p e1 d i a b e t e s[ J ] ．D i a b e t e s ，2 0 0 1 ， 5 0 ( 1 o ) ： 2 1 8 1 — 2 1 9 1 ．[ 3 ]M o o r eH P ， w a l k e rM D，F(xiàn) ． e ta 1 ． E x p r e s s i n gah u m a np r e i n s u ．1 i nc D N Ai naI n o u ~ A C T H

31、 · s e c r e t i n gc e l 1 ． I n U a e l l u l a rs t o r a g e 。p r o t e o l y t i cp r o c e s s i n g ，a n ds e c r e t i o a to ns t i m u l a t i o n [ J ] ．C e l l ，1 9 8 3 ， 3 5( 2P t1 ) ： 5 3 1 — 5 3 8 ．[

32、4 ]K e l l yR B ．P a t h w a y so fp r o t e i ns e c r e t i o ni ne u k a ~ o t e s [ J ] ．s c i ．e n e， 1 9 8 5 ， 2 3 0 ( 4 7 2 1 ) ： 2 5 — 3 2 ．[ 5 ]H C ， K i mS J ， K i mK S ， e ta 1 ． R e m i e s i o ai nm o d e l

33、s o f t y p eId i ．a(chǎn) b a t e s b yg e n et h e r a p yu s i n gas i n g l e - c h a i ni n s u l i na n a l o g u e ． N a ．t u r e， 2 0 0 0 ， 4 0 8( 6 8 1 1 ) ： 4 8 3- 4 8 8 ．s t r o k ea ndn e u r o d e g e n e r a t i

34、 v ed i s e a s e [ J ] ．A n nN e u r o ， 1 9 9 9 ， 4 5( 4 ) ： 4 2 1 — 4 2 9 ．[ 3 ]K i t a g a w aH． H a y e s h iT ， M i t s u m o t oY ．R e g u l a t i ~ o fi s c h e m i ab r a i ni n j u r yb yt o p i ca p p l i c a

35、t i o no fG D N Fa f t e rp e r m a n e n tM C A Oi nr a t s[ J ] ．S t r o k e ， 1 9 9 8 ， 2 9 ( 7 ) ： 1 4 1 7 — 1 4 2 2 ．[ 4 ]L i nL F ， D o h e r t yD H， L i l eJ D。 e ta 1 ． G D N F ： ag l i a lc e ll i n e - d e r i

36、v e dn e u n m ' o p h i cf a c t e rf Ⅲ m i d b r a i na o p mi n ~ s i e8 【 J ] ．S c i ·e n e， 1 9 9 3 ， 2 6 0 ( 5 1 1 1 ) ： 1 1 3 0 —1 1 3 2 ．[ 5 ]R o t h r e & J F ． H a r tR G ．A n t i t h m m b o t i c

37、t h e r a p yi nem b n dv a s c u l a rd i s e a s e [ J ] ．A n nI n t e r n M e d ， 1 9 9 1 ， 1 1 5 ( 1 1 ) ： 8 8 5 — 8 9 5 ．[ 6 ]S r i n v e s u l aS M， F e r n a n d e sA l n e n u iT 。 Z n~ i l iJ 。 e ta 1 ． T h ec

38、e d - 3 ／i n t e r l e u k i n1b e t ac o n v e r g i n ge n z y me · l i k eh o m o i o gMc h 6a ndt h el a m i n c l e a n i n ge n z y m eMc h 2a lp h aa r es u b s t r a t e af o rt h ea p o p t o t i cm e d i a

39、 t o rC P P 3 2 [ J ] ． JB i oC h e m， 1 9 9 6 ， 2 7 1 ( 4 3 ) ： 2 7 0 9 9 — 2 7 1 0 6 ．[ 7 ]N iB ， Wu X， S h Y ， e t a 1 ． T r a n s i e n t g l o b a l f o r e ． b r a i n i s c h e m i a i n d u c e sap r o l o n g e

40、de x p r e s s i o no f t h ec e sp e se - 3mR N Ai nr a th i p p e a m p a l sC A Ip y r a m i d a ln e u r o n s [ J ] ． JC e r e bB l o o dH o wM e t a b ， 1 9 9 8 ， 1 8( 3 ) ： 2 4 8— 2 5 6 ．維普資訊 http://www.cqvip.com