5’-UTR對STM542 flhDC基因表達(dá)的影響及敲除工具的改良.pdf

1、鞭毛是一種細(xì)菌菌體表面比菌體細(xì)很多的彎曲而細(xì)長的絲狀體，具有運(yùn)動和趨化功能，能夠幫助細(xì)菌粘附及侵襲宿主細(xì)胞，促使宿主發(fā)生促炎性反應(yīng)。鞭毛在表達(dá)調(diào)控的過程中，為了避免能量的不必要耗損，具備了一套高度有序的表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，與其自身精密的結(jié)構(gòu)組裝相配合，鞭毛才能發(fā)揮其功能。本實(shí)驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建好的含不同長度5'-UTR的flhDC全長基因及相應(yīng)啟動子片段的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化沙門氏菌STM542及大腸桿菌Top10、JM109菌株，通過測定重組菌株的動

2、力及酶活性來初步評估不同長度片段啟動子對flhDC基因表達(dá)的影響并精確測定相應(yīng)片段啟動子的活性差異。動力結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含986bp和1201bp的flhDC全長基因的重組菌株，在不同阿拉伯糖誘導(dǎo)濃度下呈現(xiàn)可誘導(dǎo)性，在誘導(dǎo)濃度為0.5％的時(shí)候動力表現(xiàn)最大。含1572bp、1752bp和1938bp的flhDC全長基因的重組菌株呈現(xiàn)不可誘導(dǎo)的趨勢，含1572bp flhDC全長基因的重組的菌株動力只比空白對照略大，其他兩個(gè)明顯大于對照。酶活性結(jié)

3、果顯示:只含空質(zhì)粒的重組菌株未經(jīng)誘導(dǎo)時(shí)的β-半乳糖苷酶的表達(dá)量很高，根據(jù)乳糖操縱子的調(diào)控機(jī)制，轉(zhuǎn)入含lacI基因的質(zhì)粒后，依然抑制不住空質(zhì)粒的酶表達(dá)，將含表達(dá)阻遏蛋白能力更強(qiáng)的lacIq基因的質(zhì)粒導(dǎo)入后，才得到抑制。1201bp、1752bp和1938bp全長flhDC基因?qū)?yīng)的啟動子經(jīng)誘導(dǎo)后表達(dá)量較高，1572bp對應(yīng)的反而比1201bp對應(yīng)的啟動子酶活性要小，推測可能是在該區(qū)域具有弱化子特征。
　　為了避免將打靶片段轉(zhuǎn)入受體菌

4、時(shí)需高感受態(tài)效率的問題，本實(shí)驗(yàn)在利用rpsL基因作為反向篩選標(biāo)記的Red敲除時(shí)，將打靶片段連接溫敏質(zhì)粒pIDM-T，可直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化。因rpsL基因反向篩選只能在其存在突變的鏈霉素抗性菌種中使用，故本實(shí)驗(yàn)對沙門氏菌527的rpsL基因進(jìn)行突變，使其變?yōu)殒溍顾乜剐跃?。在對大腸桿菌Top10進(jìn)行ngK基因敲除時(shí)，發(fā)現(xiàn)打靶片段并非整合在打靶基因處，可能是Para啟動子和Top10菌株自身rpsL基因的存在，使50bp的同源臂進(jìn)行同源重組更加困