催產(chǎn)素體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:由動(dòng)脈粥樣硬化而引發(fā)的缺血性心臟病,極易誘發(fā)急性心肌梗死,是嚴(yán)重危害人民健康的多發(fā)病。細(xì)胞性心肌成形術(shù)可以從根本上實(shí)現(xiàn)心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)修復(fù)和功能恢復(fù),是一種目前改善心梗患者心功能較有前景的治療手段。選擇恰當(dāng)?shù)摹胺N子”細(xì)胞是決定細(xì)胞性心肌成形術(shù)成功與否的關(guān)鍵,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)作為組織工程重要種子細(xì)胞,具有分布廣泛、取材方便、易分離擴(kuò)增、低免疫源性、易被

2、外源基因轉(zhuǎn)染等諸多優(yōu)點(diǎn),成為近年來國際上廣為關(guān)注的焦點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過體外分離培養(yǎng)SD大鼠的BMSCs,并用催產(chǎn)素(Oxytocin,OT)誘導(dǎo)向心肌方向分化,對分化過程進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)、心肌特異基因及轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)加以分析研究。以對OT誘導(dǎo)BMSCs向心肌細(xì)胞分化做初步探討,為進(jìn)一步研究利用BMSCs來源的心肌細(xì)胞應(yīng)用于臨床修復(fù)受損心肌奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1. BMSCs誘導(dǎo)分化
　　 利用貼壁分離篩選法從

3、SD大鼠四肢長骨骨髓中分離純化BMSCs,培養(yǎng)于含10％胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液,每隔2d換液,選生長良好的第2代BMSCs分別以含OT0.5×10-7μmnol/L、1×10-7μmol/L、3×10-7μmol/L的IMDM培養(yǎng)液分組誘導(dǎo),4d后去除誘導(dǎo)培養(yǎng)基,加入不含OT的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4周。
　　 2.免疫細(xì)胞化學(xué)染色:取各實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)后第28d的細(xì)胞,免疫細(xì)胞化學(xué)染色光鏡觀察細(xì)胞中結(jié)蛋白(desmin)、α-橫紋肌肌動(dòng)蛋

4、白(α-actin)、P38MAPK、心肌特異性肌鈣蛋白(cTnT)和肌鈣蛋白-Ⅰ(cTnⅠ)陽性細(xì)胞的表達(dá)情況,并統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率。
　　 3.免疫熒光雙標(biāo)染色技術(shù):取1×10-7μmol/L組培養(yǎng)第28d的細(xì)胞爬片,采用α-actin、cTnT進(jìn)行熒光雙重標(biāo)記,觀察二者在細(xì)胞的共表達(dá)情況。
　　 4.透射電鏡技術(shù):取1×10-7μmol/L組培養(yǎng)28d的細(xì)胞,2.5%戊二醛固定,刮下全部細(xì)胞,離心制成細(xì)胞團(tuán)塊,常

5、規(guī)脫水包埋,超薄切片后,透射電鏡觀察誘導(dǎo)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。
　　 5.采用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)的方法,選取1×10-7μmol/L組于誘導(dǎo)后第7d、14d、28d,檢測GATA-4、α-MHC和Nkx2.5的mRNA表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.免疫細(xì)胞化學(xué)檢測:誘導(dǎo)后各組的BMSCs中均可見desmin、α-actin、cTnT、cTnI和P38 MAPK陽性細(xì)胞,各種抗體細(xì)胞陽性率中1

6、×10-7μmol/L組明顯高于其他組(P＜0.01或P＜0.05)。
　　 2.免疫熒光雙標(biāo)染色:分化細(xì)胞胞漿內(nèi)α-actin、cTnT免疫熒光染色呈陽性,有α-actin表達(dá)呈紅色,cTnT表達(dá)呈綠色,當(dāng)兩者同時(shí)觀察時(shí)重疊的部位變成黃色,提示胞漿中有cTnT和α-actin共表達(dá)。
　　 3.透射電鏡觀察:分化細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)清晰完整,細(xì)胞呈條帶狀,部分細(xì)胞表面出現(xiàn)突起;胞核圓形位于細(xì)胞中央,核仁明顯;胞漿內(nèi)細(xì)胞器豐富

7、,包括高爾基復(fù)合體、糖原顆粒、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng);胞漿內(nèi)還可見細(xì)肌絲樣結(jié)構(gòu)平行排列,隱約見明暗相間的橫紋。
　　 4.半定量RT-PCR結(jié)果顯示:GATA4和Nkx2.5在BMSCs誘導(dǎo)7d后弱表達(dá),14d后表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.05),28d后表達(dá)減弱;α-MHC在BMSCs誘導(dǎo)7d后不表達(dá),14d后弱表達(dá),28d后表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.05);以上在對照組均無表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1.本研究使用IMDM培養(yǎng)基、優(yōu)質(zhì)

8、胎牛血清,采用改良的貼壁分離篩選法成功地對BMSCs體外分離、培養(yǎng),結(jié)果表明從骨髓中分離純化出的BMSCs具有良好生物活性,此方法簡單高效。
　　 2.通過對誘導(dǎo)劑OT誘導(dǎo)分化后細(xì)胞的心肌特異性結(jié)構(gòu)蛋白、心肌特異性基因表達(dá)以及形態(tài)學(xué)觀察,證實(shí)OT具有誘導(dǎo)BMSCs向心肌細(xì)胞分化的能力。
　　 3.分子水平的研究顯示,心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子GATA4和轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5在大鼠BMSCs向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化中的時(shí)序表達(dá),說明參與了