水稻細(xì)菌性基腐病病原學(xué)及檢測(cè)技術(shù)的研究.pdf

1、水稻細(xì)菌性基腐病(Dickeyazeae)是近年來(lái)我國(guó)部分省(區(qū))水稻上發(fā)生危害較為嚴(yán)重的病害之一。2008年該病在湖北首次發(fā)現(xiàn)，并在局部地區(qū)少數(shù)田塊造成毀滅性危害。建立病害快速診斷檢測(cè)體系，對(duì)于控制本病的擴(kuò)散蔓延和有效防治具有重要意義。在植物病原細(xì)菌的檢測(cè)中，傳統(tǒng)的細(xì)菌檢測(cè)不同方法，通常較為費(fèi)時(shí)，且靈敏度低，在實(shí)際應(yīng)用中均有一定的局限性。以PCR為基礎(chǔ)的分子檢測(cè)技術(shù)使植物病原細(xì)菌的檢測(cè)更快速、靈敏和可靠。繼常規(guī)PCR之后，實(shí)時(shí)熒光PC

2、R技術(shù)應(yīng)用使其檢測(cè)效果更快捷、更精確。SYBR Green法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，不需要設(shè)計(jì)探針，通用性好，成本低且能夠進(jìn)行溶解曲線分析檢驗(yàn)擴(kuò)增反應(yīng)的特異性，與常規(guī)PCR相比，靈敏度高、操作方便、無(wú)污染，避免了普通PCR后續(xù)操作污染的問(wèn)題。本研究在對(duì)水稻細(xì)菌性基腐病菌相關(guān)特性、電鏡形態(tài)特征觀察及不同水稻品種抗感病性人工接種鑒定的基礎(chǔ)上，比較評(píng)價(jià)了常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)不同來(lái)源菌株和帶菌種子及土壤檢測(cè)的靈敏性，并通過(guò)盆栽試驗(yàn)方法，觀察了

3、水稻細(xì)菌性基腐病的自然傳播途徑。研究取得了如下主要結(jié)果：
　　 1.對(duì)從湖北枝江水稻品種分離得出的細(xì)菌性基腐病菌菌株，在前期病原學(xué)研究基礎(chǔ)上，對(duì)病菌的革蘭氏染色反應(yīng)和形態(tài)特征及致病特性進(jìn)一步進(jìn)行了觀察試驗(yàn)，結(jié)果顯示，病菌革蘭氏染色為陰性反應(yīng)，菌體在電子顯微鏡下呈短桿狀，具周生鞭毛，菌體大小為(0.5-0.7)um×(1.0-2.5)um。培養(yǎng)菌株懸液，通過(guò)注射接種、傷根接種水稻植株可表現(xiàn)典型癥狀，菌液浸種可使幼芽變褐，降低出苗率

4、。根據(jù)對(duì)25個(gè)中稻品種，人工接種抗感病性鑒定顯示：不同水稻品種對(duì)基腐病的抗感病性存在明顯差異，在供試的品種中，其中有6個(gè)品種表現(xiàn)為中抗，有9個(gè)品種表現(xiàn)為中感，有9個(gè)品種表現(xiàn)為高感，水稻品種抗病性的鑒定對(duì)生產(chǎn)實(shí)際具有重要的指導(dǎo)價(jià)值。
　　 2.根據(jù)水稻細(xì)菌性基腐病菌菌株的16S-23S細(xì)菌核糖體DNA ITS區(qū)域的特異區(qū)間，設(shè)計(jì)一對(duì)檢測(cè)基腐病菌的特異性引物X1：GAGTAGAAGTGCCTGCGTG和X2：AGGTTAGCGTTG

5、ACCGTGC，經(jīng)特異性和靈敏度實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)供試的8種菌株中只有水稻細(xì)菌性基腐病菌株能夠被檢測(cè)出來(lái)，在一定的范圍內(nèi)此對(duì)引物可有效地將水稻基腐病菌和其它屬的菌區(qū)分開(kāi)來(lái)。靈敏度檢測(cè)中實(shí)時(shí)熒光PCR能檢測(cè)到的模板DNA最低濃度為5×10-3 ng/μl，以菌液為模板能檢測(cè)到的最低濃度為102cfu/ml，比常規(guī)PCR靈敏度高10-100倍。模擬土壤和種子帶菌的檢測(cè)中均能檢測(cè)到病菌，通過(guò)對(duì)人工接種的水稻莖基部病原菌的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，實(shí)時(shí)熒光PCR檢

6、測(cè)第二天就檢測(cè)到病菌的存在。應(yīng)用這對(duì)特異性引物對(duì)水稻細(xì)菌性基腐病菌進(jìn)行檢測(cè)，快捷、準(zhǔn)確。本方法可以直接對(duì)帶菌的水稻植株進(jìn)行定性檢測(cè)。
　　 3.通過(guò)對(duì)感病植株種子、病田土壤和稻兜盆栽傳病途徑試驗(yàn)結(jié)果顯示，病田土壤和病稻兜均具傳病作用，幼苗期二者均不顯癥，分蘗至孕穗期表現(xiàn)典型的癥狀，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，在分蘗期可檢測(cè)出基腐病菌。根據(jù)盆栽試驗(yàn)病害癥狀表現(xiàn)和PCR檢測(cè)結(jié)果表明，病菌可在土壤和病稻兜中存活，并成為下年度本病的初侵染來(lái)