雞胚發(fā)育過程中Sonic Hedgehog超表達對脊髓聯(lián)合神經元軸突投射及相關蛋白表達影響.pdf

1、背景：
　　Sonic Hedgehog(Shh)是一種分泌性蛋白，在細胞增殖分化，形態(tài)建成，軸突導向等方面均具有重要作用。Shh在雞胚脊索和脊髓底板表達，并向四周擴散，其所形成的濃度梯度控制脊髓背腹軸的形成。并通過結合不同受體吸引或排斥脊髓聯(lián)合神經元軸突導向，使不同神經元間形成正確的連接，形成復雜的神經網絡。研究Shh的功能，有助于更好的理解神經系統(tǒng)發(fā)育機制。
　　目的：
　　1.研究雞胚脊髓不同部位聯(lián)合神經元纖維向

2、對側喙部與尾部投射的偏好性以及喙部與尾部投射量的比值是否有統(tǒng)計學差異。
　　2.研究Shh在雞胚脊髓中超表達后對聯(lián)合神經元軸突向對側投射的影響。
　　3.研究雞胚發(fā)育過程中轉錄因子Pax(Paired box)3、Pax6、Pax7、神經鈣黏蛋白(N-Cadherin，N-Cdh)、鈣黏蛋白6(Cadherin6，Cdh6)與鈣黏蛋白7(Cadherin7，Cdh7)在雞胚脊髓中的表達模式。
　　4.研究雞胚發(fā)育過程中

3、，Shh在脊髓中超表達后對Pax基因家族Pax3、Pax6與Pax7蛋白表達以及Cdh7 mRNA表達的影響。
　　方法：
　　1.在E3時，利用雞胚脊髓活體電轉基因技術將pCAGGS-GFP質粒分別轉入雞胚頸部、前肢、胸部前段、胸部后段和后肢五個部位，E6～E6.5時取GFP陽性胚胎進行Open Book，用Image J對投射纖維進行灰度分析，SPSS統(tǒng)計分析聯(lián)合神經元纖維向對側喙部與尾部投射的偏好性以及喙部與尾部投射量

4、的比值是否有統(tǒng)計學差異。
　　2.在E2.5～E3時，對照組，利用雞胚脊髓活體電轉基因技術將pCAGGS-GFP質粒轉入雞胚脊髓一側;實驗組則將攜帶Shh基因的表達質粒pCAGGS-Shh和pCAGGS-GFP質粒共轉入雞胚脊髓一側，E6時取材切片，熒光免疫組織化學技術檢測Shh是否發(fā)生超表達，利用Open Book技術研究Shh在雞胚脊髓中超表達后對聯(lián)合神經元軸突投射的影響。
　　3.取雞胚正常發(fā)育過程E3～E6、E8和E

5、10時期的脊髓，每個時期至少取3個材料，固定、脫水、包埋、冷凍切片后，熒光免疫組織化學技術研究E4～E6時期Pax3，Pax6以及Pax7蛋白表達情況，并用原位雜交法檢測N-Cdh、Cdh6與Cdh7在雞胚脊髓發(fā)育過程中的時空表達模式。
　　4.在雞胚E2.5～E3時，實驗組，利用雞胚脊髓活體電轉將pCAGGS-Shh和pCAGGS-GFP質粒共轉入雞胚脊髓一側，對照組則只轉入報告基因質粒。E4～E6時分別取材，原位雜交檢測Shh

6、是否真正超表達，超表達后研究對Pax3、Pax6、Pax7以及Cdh7的影響。最后用Image J軟件對對照組及實驗組中四種基因在脊髓兩側的表達進行灰度分析，并利用SPSS統(tǒng)計分析對照組和實驗組中脊髓兩側Pax3、Pax6、Pax7及Cdh7的表達量是否存在統(tǒng)計學差異。
　　結果：
　　1.所研究的雞胚脊髓的5個部位中，大多數(shù)聯(lián)合神經元軸突穿越底板后均向喙部投射，少數(shù)向尾部投射。除頸部與前肢的聯(lián)合神經元纖維向對側喙部與尾部投

7、射的比值之間無統(tǒng)計學差異外（P＞0.05），五個部位兩兩之間均存在極顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。
　　2.在脊髓組織切片水平上，熒光免疫組織化學結果表明，Shh在雞胚脊髓中成功超表達，無論在組織切片上還是通過Open Book技術進行觀察，與對照組相比，超表達后轉染側神經纖維都無法正常通過底板投射到對側。
　　3.熒光免疫組織化學結果表明E4～E6期間，Pax3主要表達于脊髓翼板，生皮肌節(jié)，背根以及背根神經節(jié);Pax6主

8、要表達于跨越翼板和基板的脊髓中間部位;Pax7則主要表達于翼板、頂板和生皮肌節(jié)。原位雜交結果表明，雞胚發(fā)育早期，Cdh7主要在生皮肌節(jié)、底板、基板背部、運動柱、背根和腹根強烈表達，E8～E10，其表達主要集中在灰質區(qū)、背根神經節(jié)和腹根。
　　4.原位雜交結果表明，利用雞胚脊髓活體電轉基因技術成功建立了Shh超表達模型。免疫熒光和原位雜交結果表明，Shh超表達后，脊髓轉染側與未轉染側相比Pax3、 Pax6、Pax7以及Cdh7的表

9、達量均存在極顯著差異(P＜0.01)，這四種基因在脊髓中的表達均被抑制。
　　結論：
　　1.雞胚脊髓不同部位聯(lián)合神經元軸突向對側喙部與尾部的投射有差異。
　　2.Shh是一種軸突導向分子，雞胚脊髓中Shh超表達抑制脊髓聯(lián)合神經元軸突向對側投射。
　　3.雞胚發(fā)育過程中，Pax3、Pax6、Pax7、N-Cdh、Cdh6與Cdh7不同的表達模式預示著它們在雞胚脊髓及其周圍組織發(fā)育過程中扮演不同角色。
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