海洋微藻DNA條形碼基因的評(píng)估及環(huán)境樣本多樣性分析和定量基因的開(kāi)發(fā).pdf

1、海洋微藻不僅在海洋生態(tài)系統(tǒng)中占有十分重要的生態(tài)地位，而且其結(jié)構(gòu)成分和分泌物等是巨大的可開(kāi)發(fā)利用的海洋資源，而硅藻和甲藻是海洋微藻的主要類(lèi)群，因此，對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確地分類(lèi)鑒定是其他相關(guān)工作的研究基礎(chǔ)。DNA條形碼技術(shù)作為傳統(tǒng)分類(lèi)學(xué)鑒定的補(bǔ)充手段發(fā)揮了非常重要的作用。但硅藻和甲藻的DNA條形碼研究起步較晚，尚未找到分別適合的統(tǒng)一的DNA條形碼基因，現(xiàn)有的研究也主要是分別針對(duì)特定的分類(lèi)單元進(jìn)行條形碼基因的檢測(cè)，并未在整個(gè)類(lèi)群上對(duì)候選基因進(jìn)行過(guò)評(píng)估

2、。此外，目前對(duì)海洋微藻群落結(jié)構(gòu)的研究，一是顯微鏡檢，但該方法受限于形態(tài)學(xué)鑒定的局限性，二是利用rDNA的擴(kuò)增子測(cè)序信息來(lái)反映群落中微藻的組成結(jié)構(gòu)，但rDNA在不同真核生物中的的拷貝數(shù)差異很大。因此根據(jù)rDNA擴(kuò)增子測(cè)序所得的序列豐度對(duì)環(huán)境樣本中真核微生物群落的相應(yīng)物種的豐度評(píng)估可能存在誤差。一些拷貝數(shù)較少的核編碼的蛋白基因已被用于甲藻的系統(tǒng)發(fā)育分析，將此類(lèi)基因用于群落結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果應(yīng)該會(huì)更加準(zhǔn)確。
　　因而，本文針對(duì)研究較為廣泛的

3、硅藻，對(duì)選取的候選條形碼基因18S rDNA、ITS rDNA、COI和rbcL，分別進(jìn)行通用引物的設(shè)計(jì)和驗(yàn)證，聯(lián)合NCBI上的序列計(jì)算硅藻門(mén)各基因的遺傳差異并構(gòu)建貝葉斯樹(shù)，評(píng)估其在硅藻門(mén)內(nèi)物種的聚類(lèi)情況，以分析各段標(biāo)記適用于硅藻聚類(lèi)關(guān)系中的分類(lèi)單位;然后利用硅藻模擬混合樣本進(jìn)行rDNA擴(kuò)增子克隆測(cè)序，評(píng)估rDNA序列的豐度反應(yīng)環(huán)境樣本中真核微生物群落的相應(yīng)物種豐度的準(zhǔn)確性;并對(duì)具有一定的甲藻物種區(qū)分能力的拷貝數(shù)較低的核編碼蛋白基因（H

4、SP90、elf2、actin）設(shè)計(jì)通用引物，分析其對(duì)甲藻物種的區(qū)分度后，利用甲藻模擬群落和選定的actin基因構(gòu)建克隆文庫(kù)初步評(píng)估該基因?qū)自逦锓N進(jìn)行定量的準(zhǔn)確性;最后比較18S v9區(qū)和actin基因的Miseq測(cè)序測(cè)序結(jié)果，進(jìn)行硅藻和甲藻模擬群落的物種豐度和多樣性分析，并建立基因序列與生物量之間的關(guān)系。得到的結(jié)果如下:
　　利用設(shè)計(jì)的通用引物將18S rDNA、ITS rDNA、COI和rbcL基因在分離的37株硅藻中均獲得

5、了擴(kuò)增和測(cè)序，測(cè)得的序列Blast結(jié)果顯示，rbcL基因的正確率最高(88.9％)，18S次之，而COI的錯(cuò)誤率最高(25％)。遺傳差異和構(gòu)建的貝葉斯樹(shù)顯示，18S rDNA的遺傳變異度比較適中，可以在較高的分類(lèi)水平上對(duì)硅藻進(jìn)行聚類(lèi)，也可以對(duì)直鏈藻屬、楔形藻屬、骨條藻屬和雙肋藻科等較低分類(lèi)單位進(jìn)行聚類(lèi)分析。ITS和COI基因在硅藻門(mén)內(nèi)遺傳變異的程度很大，不再適用于較高分類(lèi)單位的聚類(lèi)分析，但是ITS適合用于海鏈藻目物種的DNA條形碼鑒定和

6、系統(tǒng)發(fā)育分析，而COI則更適合于羽紋硅藻的一些屬的物種聚類(lèi)分析和DNA條形碼鑒定。rbcL基因相對(duì)18S更加保守，但是并不能在高分類(lèi)階元上進(jìn)行硅藻的聚類(lèi)分析，卻可以聚類(lèi)異極藻屬、骨條藻屬、冠盤(pán)藻科和根管藻科等個(gè)別較低分類(lèi)單位的物種序列。
　　利用rDNA擴(kuò)增子測(cè)序進(jìn)行微藻群落中物種豐度的分析結(jié)果，以DNA為模板比以藻液為模板所構(gòu)建的克隆文庫(kù)檢測(cè)到的物種多，但都只檢測(cè)出少量物種并存在相同的物種擴(kuò)增偏好性，且兩個(gè)文庫(kù)檢測(cè)到的物種的比例

7、與樣本的細(xì)胞比例差異很大，一方面說(shuō)明rDNA在不同硅藻物種中的拷貝數(shù)存在很大差異，另一方面說(shuō)明rDNA構(gòu)建克隆文庫(kù)評(píng)估硅藻群落甚至真核微生物的組成結(jié)構(gòu)存在很大誤差。同時(shí)還檢測(cè)到在不同的硅藻培養(yǎng)物內(nèi)都存在ITS序列變異，但是變異程度很小(p＜0.013)。
　　對(duì)拷貝數(shù)較少的核編碼的蛋白基因HSP90、elf2和actin基因設(shè)計(jì)通用引物并在8株甲藻中進(jìn)行擴(kuò)增和聚類(lèi)分析，結(jié)果顯示actin基因在擴(kuò)增率、序列可利用率和物種的區(qū)分能力上

8、均顯示了一定的優(yōu)勢(shì)，基本上可以將甲藻在屬水平進(jìn)行區(qū)分和聚類(lèi)。甲藻混合樣本的actin基因克隆文庫(kù)的構(gòu)建和分析結(jié)果顯示，actin基因能夠?qū)?個(gè)物種全部檢出，序列與細(xì)胞的比例尚存在誤差，但在屬水平的誤差要小于種水平的誤差，物種檢出率高于rDNA，豐度偏差低于rDNA。
　　采用Miseq測(cè)序?qū)?個(gè)模擬的硅藻和甲藻混合樣本分別進(jìn)行了18S v9區(qū)和actin基因的測(cè)序分析結(jié)果顯示，rDNA擴(kuò)增子測(cè)序進(jìn)行微藻群落結(jié)構(gòu)分析的誤差很大，用1