新西蘭匍柄霉(Stemphylium eturmiunum)中與ASF1,STE2和STE3互作蛋白的篩選.pdf

1、匍柄霉屬(Stemphylium)是絲狀子囊真菌中的一類重要真菌類群，在自然界中該屬真菌絕大多數(shù)以無性態(tài)形式存在，但也有一小部分存在有性生殖階段，而新西蘭匍柄霉（Stemphylium eturmiunum）就是其中能產(chǎn)生有性態(tài)的種類之一。為了研究新西蘭匍柄霉（S.eturmiunum）與其它匍柄霉屬種在有性態(tài)進(jìn)化方面的區(qū)別，我們查閱資料發(fā)現(xiàn)真菌的有性進(jìn)化受若干性別相關(guān)因子的調(diào)控。研究表明，信息素受體基因STE2和STE3在模式菌釀酒酵

2、母、粗糙脈孢菌等菌中都有調(diào)控有性發(fā)育通路的作用。此外，反沉默因子ASF1對(duì)有性發(fā)育也有著一定的調(diào)控作用。研究表明，△STE2、△STE3和△ASF1單突變菌株在適宜的環(huán)境下培養(yǎng)均不能產(chǎn)生有性態(tài)。
　　真菌異宗配合發(fā)生在兩種細(xì)胞類型：a和α之間，細(xì)胞類型由分泌的信息素控制。兩種類型細(xì)胞分別能產(chǎn)生兩種信息素前體a和α，及兩種相應(yīng)的信息素受體STE2和STE3。在有性生殖過程中，經(jīng)過加工的信息素α因子被a細(xì)胞表面的STE2受體識(shí)別，啟動(dòng)

3、交配信號(hào)；同樣，經(jīng)過加工的信息素a因子被α細(xì)胞表面的STE3受體識(shí)別，啟動(dòng)交配信號(hào)。為了進(jìn)一步探索敲除信息素受體基因STE2和STE3后，是否影響其它上下游基因的表達(dá)，我們以新西蘭匍柄霉（S.eturmiunum）為實(shí)驗(yàn)材料，主要進(jìn)行了如下研究：利用Trizol法分別對(duì)△STE2和△STE3單突變菌株提取總RNA并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)果表明敲除信息素受體基因STE2或STE3會(huì)影響其上下游一系列基因的正常轉(zhuǎn)錄。經(jīng)過分析與預(yù)測(cè)，我們從中選取

4、了一系列差異表達(dá)比較大的基因，試圖篩選信息素受體STE2和STE3的互作蛋白。通過基因序列的比對(duì)，我們發(fā)現(xiàn)STE2和STE3基因各含有一個(gè)內(nèi)含子。我們通過OverLap PCR獲得了沒有內(nèi)含子的基因序列，并在隨后的酵母雙雜實(shí)驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)信息素受體STE2和ORF07010(糖苷水解酶家族32蛋白)能夠相互作用。
　　反沉默因子 ASF1( anti-silencing function1)在進(jìn)化上非常保守，而且是組蛋白H3/H4

5、的分子伴侶，在基因轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制和修復(fù)等多個(gè)染色質(zhì)層面的生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的作用。通過同源序列比對(duì)，我們發(fā)現(xiàn)新西蘭匍柄霉(S.eturmiunum)基因組中含有ASF1基因。根據(jù)已報(bào)到的ASF1基因的信息，設(shè)計(jì)特異性引物克隆了新西蘭匍柄霉(S.eturmiunum)中的反沉默因子ASF1和組蛋白H3、H4的基因。同時(shí)利用酵母雙雜以及Pull-down實(shí)驗(yàn)技術(shù)證明，ASF1確實(shí)能與組蛋白H4互作，但與組蛋白H3不存在相互作用，這可能