蔥葉枯匍柄霉(Stemphylium botryosum)交配型基因MAT1-1、MAT1-2敲除載體的構建及遺傳轉化系統(tǒng)的建立.pdf

1、匍柄霉（Stemphylium）是絲狀真菌中一類重要的真菌類群，在自然界中該屬內真菌絕大多數以無性態(tài)形式存在，但也有一小部分存在有性生殖階段。研究發(fā)現該屬內真菌交配型位點分為三種情況:只有MAT1-1或MAT1-2，或既有MAT1-1又有MAT1-2，且MAT1-1發(fā)生倒置后與MATT1-2連接在一起。其獨特的交配型結構為研究真菌有性生殖機制及進化趨勢提供了良好的材料。
　　 蔥葉枯匍柄霉（Stemphylium botryos

2、um）作為該屬內的代表種，同一菌株內含有MAT1-1和MAT1-2兩個交配型基因，且在實驗室條件下易誘導產生有性態(tài)。為深入研究交配型基因及其他相關基因的功能，本研究分別構建了這兩個基因的敲除載體并對敲除轉化體系的建立進行了初步的探索。
　　 以從CBS（荷蘭）菌種標本館交換獲得的標準菌株S.botryosum(CBS122441)為試驗材料，現保存在山東農業(yè)大學真菌及真菌資源利用研究室，進行了以下內容研究:
　　 1.根

3、據已報道的MAT1-1、MAT1-2基因信息，通過Southern雜交分別檢測了野生型菌株內兩個基因的拷貝數，確定了其敲除的有效性;
　　 2.分別擴增了MAT1-1、MAT1-2兩基因的側翼序列，以pBIG3C28a為基礎載體構建了MAT1-1基因敲除載體pBIG3C28a-1R-1L及MAT1-2基因敲除載體pBIG3C28a-2R-2L;
　　 3.構建了PEG介導的原生質體轉化系統(tǒng):在原生質體的制備與再生中分析了

4、酶種類及濃度、酶解時間、酶解溫度、菌齡以及穩(wěn)滲劑種類等因素的影響，最終得出15 mg/mL裂解酶、10 mg/mL溶壁酶、10 mg/mL蝸牛酶及5 mg/mL纖維素酶四種酶組合用0.7 mol/L的NaCl作為穩(wěn)滲劑在30℃下酶解培養(yǎng)36h的菌絲3.5 h可制備出足以用于轉化的原生質體，采用1 mol/L蔗糖作為穩(wěn)滲劑再生可得到良好的再生效果，并通過PEG介導轉化成功;
　　 4.構建了根癌農桿菌介導的遺傳轉化系統(tǒng):通過對AS