蔥葉枯匍柄霉(Stemphylium botryosum)交配型基因MAT1-1、MAT1-2敲除載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立.pdf

1、匍柄霉（Stemphylium）是絲狀真菌中一類重要的真菌類群，在自然界中該屬內(nèi)真菌絕大多數(shù)以無性態(tài)形式存在，但也有一小部分存在有性生殖階段。研究發(fā)現(xiàn)該屬內(nèi)真菌交配型位點(diǎn)分為三種情況:只有MAT1-1或MAT1-2，或既有MAT1-1又有MAT1-2，且MAT1-1發(fā)生倒置后與MATT1-2連接在一起。其獨(dú)特的交配型結(jié)構(gòu)為研究真菌有性生殖機(jī)制及進(jìn)化趨勢(shì)提供了良好的材料。
　　 蔥葉枯匍柄霉（Stemphylium botryos

2、um）作為該屬內(nèi)的代表種，同一菌株內(nèi)含有MAT1-1和MAT1-2兩個(gè)交配型基因，且在實(shí)驗(yàn)室條件下易誘導(dǎo)產(chǎn)生有性態(tài)。為深入研究交配型基因及其他相關(guān)基因的功能，本研究分別構(gòu)建了這兩個(gè)基因的敲除載體并對(duì)敲除轉(zhuǎn)化體系的建立進(jìn)行了初步的探索。
　　 以從CBS（荷蘭）菌種標(biāo)本館交換獲得的標(biāo)準(zhǔn)菌株S.botryosum(CBS122441)為試驗(yàn)材料，現(xiàn)保存在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌及真菌資源利用研究室，進(jìn)行了以下內(nèi)容研究:
　　 1.根

3、據(jù)已報(bào)道的MAT1-1、MAT1-2基因信息，通過Southern雜交分別檢測(cè)了野生型菌株內(nèi)兩個(gè)基因的拷貝數(shù)，確定了其敲除的有效性;
　　 2.分別擴(kuò)增了MAT1-1、MAT1-2兩基因的側(cè)翼序列，以pBIG3C28a為基礎(chǔ)載體構(gòu)建了MAT1-1基因敲除載體pBIG3C28a-1R-1L及MAT1-2基因敲除載體pBIG3C28a-2R-2L;
　　 3.構(gòu)建了PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化系統(tǒng):在原生質(zhì)體的制備與再生中分析了

4、酶種類及濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度、菌齡以及穩(wěn)滲劑種類等因素的影響，最終得出15 mg/mL裂解酶、10 mg/mL溶壁酶、10 mg/mL蝸牛酶及5 mg/mL纖維素酶四種酶組合用0.7 mol/L的NaCl作為穩(wěn)滲劑在30℃下酶解培養(yǎng)36h的菌絲3.5 h可制備出足以用于轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體，采用1 mol/L蔗糖作為穩(wěn)滲劑再生可得到良好的再生效果，并通過PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化成功;
　　 4.構(gòu)建了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng):通過對(duì)AS