甲烷飽和鹽水對(duì)慢性炎性痛模型大鼠鎮(zhèn)痛作用的研究.pdf

1、研究目的:
　　慢性炎性痛，是臨床病理性疼痛的主要類型之一，如果得不到及時(shí)而有效的治療，將成為一個(gè)代價(jià)高昂的健康問題，不但降低了病人的生活品質(zhì)，另一方面也帶給病人個(gè)體、家庭及政府沉重的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)負(fù)擔(dān)，因此慢性炎性痛防治是一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問題。而由于其病理生理機(jī)制復(fù)雜，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多變，給臨床實(shí)踐（臨床診斷與治療）和基礎(chǔ)科學(xué)研究帶來重大的挑戰(zhàn)與機(jī)遇。既往研究表明，氧化應(yīng)激與神經(jīng)炎癥均是慢性炎性痛發(fā)病的主要機(jī)制之一。在外周組織損傷、

2、感染或腫瘤生長(zhǎng)的情況下，脊髓膠質(zhì)細(xì)胞活化合成分泌多種炎癥介質(zhì)和氧化應(yīng)激產(chǎn)物、降低抗氧化能力，這些因素互相作用，構(gòu)成局部炎癥微環(huán)境，最終改變突觸傳遞的可塑性，從而形成了中樞敏化。其主要表現(xiàn)為自發(fā)痛，痛覺過敏和痛覺異常。
　　甲烷(CH4)，無色無味，分子量小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，是天然氣和煤氣等氣體燃料及可燃冰的主要成分。甲烷可以通過哺乳動(dòng)物腸道中的厭氧菌利用食物中的碳水化合物無氧酵解產(chǎn)生。由于吸入甲烷混合氣存在易爆危險(xiǎn)，目前研究多采用甲烷飽

3、和鹽水研究其生理作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在低氧條件下，甲烷可在大鼠肝臟線粒體和真核細(xì)胞中生成，并具有抗氧化、抗炎和抗細(xì)胞凋亡的作用;而這些作用在后續(xù)的缺血再灌注、膿毒癥和結(jié)腸炎等模型中得到證實(shí)，并顯示其具有神經(jīng)保護(hù)作用。然而甲烷是否對(duì)大鼠慢性炎性痛具有治療作用尚未見報(bào)道。本研究擬觀察甲烷對(duì)完全弗式佐劑誘導(dǎo)的慢性炎性痛的痛行為學(xué)的影響，探索其可能的作用機(jī)制。
　　研究方法:
　　本研究采用CFA注射至大鼠踝關(guān)節(jié)致炎建立大鼠慢性炎性痛

4、模型，運(yùn)用免疫組織化學(xué)法、流式細(xì)胞術(shù)、western blot及ELASA等實(shí)驗(yàn)方法，依下面所述步驟初步觀察甲烷飽和鹽水對(duì)慢性炎性痛大鼠的痛行為的作用，探索其相關(guān)作用機(jī)制。
　　一、觀察甲烷飽和鹽水對(duì)慢性炎性痛大鼠痛行為的影響
　　選擇SD大鼠(體重約200-300g)建立單關(guān)節(jié)炎慢性炎性痛模型。觀察MA大鼠在單次腹腔內(nèi)或者重復(fù)腹腔內(nèi)注射甲烷飽和鹽水后，術(shù)測(cè)后足機(jī)械痛縮腿反應(yīng)閾值(Paw withdrawal thresho

5、ld，PWT)變化情況。
　　二、觀察甲烷飽和鹽水對(duì)慢性炎性痛大鼠膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響
　　建立MA模型，腹腔注射甲烷飽和鹽水或者生理鹽水后，術(shù)后第10d取同側(cè)脊髓背角，用免疫蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物GFAP及小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物IBA1的表達(dá)水平。探討甲烷飽和鹽水是否通過調(diào)節(jié)膠質(zhì)細(xì)胞活性來治療慢性炎性痛。
　　三、觀察甲烷飽和鹽水對(duì)于慢性炎性痛大鼠脊髓外周T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的影響
　　建立MA模型，

6、腹腔注射甲烷飽和鹽水或者生理鹽水后，術(shù)后第10d取脊髓腰膨大，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脊髓腰膨大節(jié)段中T細(xì)胞數(shù)量。探討甲烷飽和鹽水與慢性炎性痛大鼠外周T淋巴細(xì)胞脊髓浸潤(rùn)的關(guān)系。
　　四、觀察甲烷飽和鹽水對(duì)脊髓氧化應(yīng)激水平的影響
　　建立慢性炎性痛模型后，用分光光度法檢測(cè)術(shù)后第0d、3d、7d、10d同側(cè)脊髓背角氧化應(yīng)激的標(biāo)記物超氧化物歧化酶(Superoxyde dismutase:SOD)及過氧化氫酶(catalase:CAT)活

7、性及丙二醛(malonaldehyde:MDA)濃度，用免疫組織化學(xué)的方法術(shù)后第10d檢測(cè)同側(cè)脊髓背角細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平即8羥基脫氧鳥苷(8OHDG)表達(dá)情況。初步分析甲烷飽和鹽水是否通過抗氧化應(yīng)激途徑來影響慢性炎性痛。
　　五、觀察甲烷飽和鹽水對(duì)于慢性炎性痛大鼠脊髓炎癥介質(zhì)的表達(dá)的影響
　　建立MA模型，腹腔注射甲烷飽和鹽水或者生理鹽水后，用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)第10d同側(cè)脊髓背角中炎性因子（白介素1β、腫瘤壞死因子α、白

8、介素10）的表達(dá)情況;探討甲烷飽和鹽水能否抑制脊髓背角炎癥介質(zhì)的表達(dá)。
　　研究結(jié)果:
　　一、甲烷飽和鹽水可以顯著提高慢性炎性痛大鼠機(jī)械痛縮腿反應(yīng)閾值
　　與NS處理相比，單次MS(10ml/kg)經(jīng)腹腔注射后(SD大鼠分兩組，術(shù)后第3天分別接受NS或MS腹腔注射，間隔2天后分別接受MS或NS腹腔注射)可暫時(shí)升高M(jìn)A大鼠的PWT，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);這種效應(yīng)具體表現(xiàn)為在處理后1h達(dá)到峰值，而后開始降低

9、，總有效時(shí)間大約4h。而MS連續(xù)給藥（術(shù)前1h及術(shù)后每天給藥一次，共計(jì)11次）于術(shù)后第3天開始可顯著提高大鼠的PWT，并至少持續(xù)到第10天(p＜0.05)。
　　二、甲烷飽和鹽水可抑制膠質(zhì)細(xì)胞的活化
　　踝關(guān)節(jié)致炎后同側(cè)脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞顯著活化(p＜0.05)。與生理鹽水組相比，甲烷飽和鹽水組大鼠術(shù)側(cè)脊髓背角中小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化程度顯著降低(p＜0.05)。
　　三、甲烷飽和鹽水可抑制外周T

10、淋巴細(xì)胞的脊髓浸潤(rùn)
　　與假手術(shù)組相比，踝關(guān)節(jié)致炎能夠誘導(dǎo)外周T淋巴細(xì)胞向同側(cè)脊髓背角浸潤(rùn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.001)。與生理鹽水組相比，甲烷飽和鹽水組大鼠術(shù)側(cè)脊髓背角中CD3+T細(xì)胞占單核細(xì)胞的比例顯著降低(p＜0.01)。
　　四、甲烷飽和鹽水顯著降低慢性炎性痛大鼠脊髓背角氧化應(yīng)激水平
　　與假手術(shù)組相比，MA組大鼠脊髓SOD、CAT活性降低，氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA和8OHDG表達(dá)上調(diào)(p＜0.01)。而甲烷

11、飽和鹽水連續(xù)給藥可以部分恢復(fù)MA誘導(dǎo)的脊髓背角SOD和CAT的活性(p＜0.05)。同時(shí)，與生理鹽水組相比，甲烷飽和鹽水處理組脊髓背角氧化產(chǎn)物MDA和細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)物8OHDG的表達(dá)下調(diào)(p＜0.05)。
　　五、甲烷飽和鹽水能夠降低慢性炎性痛大鼠脊髓炎性介質(zhì)表達(dá)水平
　　與假手術(shù)組相比，MA組大鼠術(shù)側(cè)脊髓背角中促炎細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α)表達(dá)上調(diào)，抑炎細(xì)胞因子IL-10表達(dá)下調(diào)(p＜0.05)。而甲烷飽和鹽水連

12、續(xù)給藥后可以抑制模型大鼠脊髓背角IL-1β和TNF-α的過表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)IL-10的表達(dá)(p＜0.05)。
　　研究結(jié)論:
　　在CFA誘導(dǎo)的單關(guān)節(jié)炎慢性疼痛模型大鼠中，腹腔注射甲烷飽和鹽水能顯著提高模型大鼠PWT，同時(shí)抑制脊髓膠質(zhì)細(xì)胞活化、減少外周T細(xì)胞脊髓浸潤(rùn)數(shù)量，下調(diào)氧化應(yīng)激產(chǎn)物及促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，保護(hù)抗氧化能力及上調(diào)抑炎細(xì)胞因子的表達(dá)，最終減輕大鼠的慢性炎性痛。本研究提示，甲烷飽和鹽水可能通過抗氧化應(yīng)激和抗神經(jīng)炎癥