腺苷對戊四氮誘導(dǎo)的癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠模型mTOR的影響及其機(jī)制探討.pdf

1、背景:
　　癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)第二大常見疾病，多為慢性反復(fù)發(fā)作性病程，部分具有難治性特點(diǎn)，在給患者造成身體心理危害的同時(shí)，也給患者的社會功能及家庭、社會帶來巨大的損害及負(fù)擔(dān)。人類已經(jīng)與之搏斗多年，目前對其機(jī)制的研究主要集中在神經(jīng)遞質(zhì)、離子通道、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、突觸聯(lián)系、遺傳及免疫等的異常及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)功能異常等學(xué)說。盡管已經(jīng)付出很多努力，進(jìn)行了多方面的探討及研究，開發(fā)了一些新的抗癲癇藥物，取得一定臨床治療效果，但仍有很多癲癇患者在現(xiàn)有藥物及

2、手段的治療條件下，仍然反復(fù)發(fā)作，具有難治性特點(diǎn)。因此，仍需要對癲癇的機(jī)制不斷的進(jìn)一步開展深入研究，尋找新的治療切入點(diǎn)，開發(fā)新的治療靶點(diǎn)和藥物。
　　近年來的研究發(fā)現(xiàn)mTOR和腺苷在癲癇發(fā)生、發(fā)展及終止中均發(fā)揮重要作用，是研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)腺苷在癲癇發(fā)作時(shí)明顯增多，系統(tǒng)或局部應(yīng)用腺苷或影響腺苷產(chǎn)量的腺苷激酶抑制劑均可有效控制癲癇發(fā)作，而腺苷腺苷受體基因敲除鼠可影響癲癇發(fā)作，說明腺苷參與了癲癇發(fā)病機(jī)制。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)腺苷本身可通過影

3、響遞質(zhì)釋放、突觸可塑性及離子通道變化、突觸后膜穩(wěn)定性等多方面參與癲癇發(fā)病機(jī)制，腺苷A1受體在其中介導(dǎo)抗癲癇作用，而A2a受體的激活可能起到反作用，其他受體在其中機(jī)制更欠明確。目前，雖然腺苷已經(jīng)在心內(nèi)科得到應(yīng)用，但鑒于大量腺苷在全身性用藥時(shí)在心血管、呼吸系統(tǒng)等方面的副作用，不能有效應(yīng)用于癲癇的臨床防治，為此人們開發(fā)了多種局部增強(qiáng)腺苷的療法，在腦內(nèi)局部增強(qiáng)腺苷的釋放，而無全身用藥時(shí)的副作用，此法在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中均取得較好效果，有望成為新的抗癲癇

4、治療方法。mTOR最早在腫瘤中被發(fā)現(xiàn)及研究，隨后在結(jié)節(jié)性硬化患者中發(fā)現(xiàn)，其抑制劑雷帕霉素可有效減少結(jié)節(jié)性硬化患者的癲癇發(fā)作頻率和程度，從而開啟了mTOR參與癲癇發(fā)作機(jī)制的研究。目前其抑制劑雷帕霉素也已經(jīng)應(yīng)用于結(jié)節(jié)性硬化等相關(guān)疾病的治療，在發(fā)揮免疫抑制作用的同時(shí)具有抗癲癇發(fā)作作用，而且發(fā)現(xiàn)雷帕霉素可以逆轉(zhuǎn)癲癇導(dǎo)致的中樞神經(jīng)的異常病理改變，證明mTOR在癲癇發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。mTOR可以通過影響離子通道變化、細(xì)胞自噬及炎癥等參與癲癇發(fā)

5、作機(jī)制，下游的p70S6和4E-BP1可控制蛋白的翻譯，影響細(xì)胞代謝及凋亡。新型mTOR抑制劑依維莫司也已經(jīng)逐漸應(yīng)用于臨床，較之雷帕霉素具有更好的耐受性和更少的副作用，有望成為某些癲癇新的治療藥物。
　　既往研究中，發(fā)現(xiàn)腺苷在腫瘤中可通過PI3K/Akt影響mTOR表達(dá);而mTOR可能也參與了能量代謝，二者在癲癇中的關(guān)系無相關(guān)研究。本研究通過閱讀復(fù)習(xí)既往文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)腺苷參與的能量代謝可導(dǎo)致AMP/ATP比值變化，而這種變化可進(jìn)一步激

6、活A(yù)MPK途徑，而AMPK為mTOR上游抑制因子，可有效抑制mTOR的表達(dá)，腺苷升高及抑制mTOR的表達(dá)均可有效抑制癲癇發(fā)作。本研究基于此認(rèn)為二者在癲癇發(fā)作中存在相互關(guān)聯(lián)，腺苷在癲癇發(fā)作中可能對mTOR的表達(dá)產(chǎn)生影響，二者存在上下游關(guān)系，因此，對二者在癲癇發(fā)作中的關(guān)系進(jìn)行系統(tǒng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)展開研究探討。對二者在癲癇發(fā)作中的關(guān)系進(jìn)行研究，有利于增強(qiáng)對癲癇發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步認(rèn)識，并將目前繁瑣的癲癇發(fā)病機(jī)制進(jìn)行有效結(jié)合，有利于形成相對簡單及系統(tǒng)的癲癇

7、發(fā)病機(jī)制新認(rèn)識，開創(chuàng)新的局面。
　　目的:
　　基于既往研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)腺苷和mTOR之間存在理論上的聯(lián)系，本研究利用戊四氮誘導(dǎo)的癲癇持續(xù)狀態(tài)的Wistar小鼠模型探討腺苷在癲癇發(fā)作中對mTOR的影響及其之間可能存在的機(jī)制，在取得初步結(jié)果后，對腺苷系統(tǒng)注射后對mTOR影響的時(shí)效性進(jìn)行了初步探討。
　　方法:
　　1、在PTZ癲癇模型中腺苷對mTOR表達(dá)的影響:取成熟雄性Wistar大鼠（200-220g）為實(shí)驗(yàn)對象

8、，分為空白對照組、PTZ誘發(fā)癲癇組及ADO實(shí)驗(yàn)組，每組8只，空白組以生理鹽水/DMS0等溶劑為試劑;癲癇組先注射DMSO，半小時(shí)后腹腔內(nèi)注射PTZ(55-75mg/kg)誘發(fā)癡癇持續(xù)狀態(tài);實(shí)驗(yàn)組先注射腺苷，半小時(shí)后注射PTZ誘發(fā)癲癇持續(xù)狀態(tài)，癲癇發(fā)作持續(xù)1小時(shí)后以10％水合氯醛終止癲癇發(fā)作，3小時(shí)后取各組海馬以western blot分別檢測空白對照組、PTZ及ADO干預(yù)組大鼠海馬的p-mTOR、mTOR、p-S6及β-actin。同時(shí)

9、免疫組化進(jìn)一步檢測各組海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)p-mTOR進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　2、腺苷對mTOR影響的機(jī)制的探討:為進(jìn)一步探討其中機(jī)制，設(shè)立了空白對照組、ADO組和AMPK抑制劑組，其中AMPK抑制劑組先注射Compound C抑制AMPK的表達(dá)，理論上阻斷ADO對mTOR影響后，再注射ADO，分別取各組海馬，western blot觀察海馬區(qū)磷酸化mTOR的變化。免疫組化進(jìn)一步檢測各組海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)p-mTOR進(jìn)一步

10、驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　3、腺苷對mTOR影響的時(shí)效性:為進(jìn)一步探討腹腔注射ADO對mTOR的影響的時(shí)效關(guān)系，進(jìn)一步分別在ADO注射后60min、120min、180min及360min利用western技術(shù)檢測大鼠海馬p-mTOR的變化。同樣，免疫組化進(jìn)一步檢測各組海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)p-mTOR進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　結(jié)果:
　　1、相關(guān)試驗(yàn)藥物對大鼠行為學(xué)影響:PTZ(55-75mg/kg)可導(dǎo)致急性的癲癇持續(xù)狀

11、態(tài)發(fā)作，ADO(200mg/kg)可導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)少動、思睡及類似哮喘樣發(fā)作，在此劑量下，副作用較大。腺苷對PTZ導(dǎo)致的癲癇發(fā)作行為的抑制作用本次實(shí)驗(yàn)未觀察。Wistar大鼠在注射AMPK抑制劑Compound C后出現(xiàn)波浪樣肌肉震顫，對PTZ誘導(dǎo)的癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作極度不耐受，死亡率極高(19/20)。
　　2、在PTZ導(dǎo)致的Wistar大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)的模型中腺苷抑制mTOR的表達(dá):發(fā)現(xiàn)PTZ組的p-mTOR/mTOR、p-S6/

12、β-actine較空白列照組明顯增高(P＜0.05)，而在PTZ之前注射ADO預(yù)處理的ADO組可見p-mTOR/mTOR、p-S6/β-actine比值較PTZ組明顯降低(P＜0.05)。免疫組化進(jìn)一步驗(yàn)證了western blot的結(jié)果，CA1區(qū)(對照組:109.9±8.8，PTZ組:311.7±27.3，ADO+PTZ組:129.17±10.1)和CA3區(qū)(對照組，297.2±25.5;PTZ組，369.5±32.1;ADO+PTZ

13、組，276.0±23.5)(P＜0.05,n=8)。
　　3、ADO可通過AMPK途徑影響mTOR表達(dá):在正常大鼠中，ADO腹腔注射較空白對照組相比，可顯著抑制p-mTOR和p-S6的表達(dá)(P＜0.05);而與提前注射AMPK抑制劑Compound C的實(shí)驗(yàn)組相比，該抑制作用被逆轉(zhuǎn)該，p-mTOR和p-S6的表達(dá)明顯恢復(fù)(P＜0.05)。免疫組化進(jìn)一步驗(yàn)證了該結(jié)果，海馬CA1區(qū)（對照組，112.6±12.6;ADO組，77.7±9

14、.1;Compound C+ADO組，104.1±12.0）和CA3區(qū)(對照組，256.3±21.8;ADO組，132.5±5.5;Compound C+ADO組，197.8±16.2).(P＜0.05，n=8).
　　4、腺苷對p-mTOR影響的時(shí)效關(guān)系:在正常大鼠中，腺苷隨時(shí)間而逐漸抑制mTOR表達(dá)，約在3h時(shí)抑制作用最明顯(P＜0.05)，此后抑制作用減弱，6小時(shí)時(shí)基本恢復(fù)正常水平。免疫組化進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果。
　　結(jié)論:

15、
　　1、腺苷可導(dǎo)致wistar大鼠出現(xiàn)思睡、少動及哮喘發(fā)作，有抑制作用;Compound C可引起大鼠肌肉出現(xiàn)波浪樣波動，對PTZ導(dǎo)致的癲癇發(fā)作極度不耐受。
　　2、在PTZ誘導(dǎo)的wistar大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)中，腺苷可明顯抑制p-mTOR及其下游的p-S6表達(dá);
　　3、在正常wistar大鼠中，腺苷可能是通過AMPK途徑抑制mTOR磷酸化活化;
　　4、在正常wistsar大鼠中，腺苷在3小時(shí)時(shí)對mTOR表達(dá)