戊四氮誘導(dǎo)發(fā)育鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬內(nèi)神經(jīng)發(fā)生的研究.pdf

1、目的:癲癇是腦神經(jīng)元過度放電而引起的反復(fù)發(fā)作性腦功能障礙,其中癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)為一種嚴(yán)重的癲癇發(fā)作形式,嚴(yán)重影響著兒童發(fā)育和健康。在癲癇患者中約20％-25％的患者即使科學(xué)的應(yīng)用抗癲癇藥物,發(fā)作仍難控制,成為難治性癲癇,因此迫切需要尋求新的有效的治療方法。研究表明神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)移植的研究可為難治性癲癇的治療帶來一線曙光。NSCs增殖、遷移、分化、存活等演化過程是一個(gè)神經(jīng)發(fā)生過程。成年大鼠的癲癇性發(fā)作等可導(dǎo)致NSCs的廣泛增殖

2、,由于發(fā)育鼠與成年鼠存在各方面的差異,用成年鼠的研究資料不能完全解釋發(fā)育鼠的大腦癲癇后的反應(yīng)機(jī)制。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇發(fā)育期大鼠觀察SE后海馬齒狀回(dentate gyrus,DG)的神經(jīng)發(fā)生特點(diǎn),為神經(jīng)干細(xì)胞移植治療癲癇提供科學(xué)的參考依據(jù)。
　　 方法:選擇生后7天(P7)、P14、P21、P28四個(gè)日齡組SD大鼠,每個(gè)日齡組大鼠隨機(jī)分為癲癇持續(xù)狀態(tài)組(PTZ組)和正常對(duì)照組(NS組),戊四氮點(diǎn)燃SE后,通過免疫組化法觀察發(fā)作后

3、不同時(shí)間點(diǎn)的DG區(qū)細(xì)胞增殖情況。同時(shí)又選擇P14大鼠為研究對(duì)象,通過標(biāo)記5-溴脫氧尿核苷(Brdu)、NeuN、GFAP觀察NSCs分化情況。
　　 結(jié)果:1、點(diǎn)燃模型的建立及癲癇持續(xù)狀態(tài)行為觀察:PTZ組大鼠發(fā)作達(dá)3.5級(jí)以上,持續(xù)1小時(shí),NS組無驚厥。2、NSCs增殖與遷移情況(nestin免疫組化):(1)在各個(gè)日齡鼠SE發(fā)作后第1天齒狀回出現(xiàn)nestin陽性細(xì)胞,但是增加峰值的低于NS組,SE發(fā)作后第7天nestin陽性

4、細(xì)胞逐漸增多,SE發(fā)作后第14天達(dá)到峰值,SE發(fā)作后第21天逐漸減少,第28天下降至最低。其中,SE發(fā)作后第7、14天幼鼠齒狀回nestin陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于各自的NS組(P＜0.05),總體表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。在各個(gè)日齡的相應(yīng)正常發(fā)育鼠腦齒狀回中nestin表達(dá)隨著日齡的增加而逐漸減少。(2)在SE發(fā)作后同一時(shí)間點(diǎn),齒狀回內(nèi)NSCs增殖強(qiáng)度具有明顯的年齡相關(guān)性。在SE發(fā)作之后第1天nestin陽性細(xì)胞數(shù)隨著大鼠日齡的增加而逐漸呈

5、下降趨勢(shì),而且P7日齡大鼠與其他三個(gè)日齡組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。同樣現(xiàn)象也存在于SE發(fā)作后第7、14、21天三個(gè)時(shí)間觀察點(diǎn)。而對(duì)于正常發(fā)育鼠來說年齡越小nestin表達(dá)強(qiáng)度越大,年齡增大nestin表達(dá)減弱。(3)在SE發(fā)作后第1天及第7天時(shí)大部分nestin陽性細(xì)胞分布于顆粒下層,發(fā)作后第14天nestin陽性細(xì)胞逐漸向顆粒細(xì)胞層遷移,遷移時(shí)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變。(4)在SE發(fā)作后第7天-第28天有少部分nestin陽性

6、細(xì)胞異位遷移入海馬的門區(qū)和內(nèi)分子層,異位遷移現(xiàn)象在P14、P21、P28三個(gè)日齡組均可觀察到,但在P7日齡組未見。(5)nestin陽性細(xì)胞不僅發(fā)現(xiàn)于齒狀回,還存在于海馬CA1、CA3及大腦皮層某些區(qū)域,如頂皮質(zhì)區(qū)等。而且不同部位的細(xì)胞形態(tài)不同。3、NSCs分化情況(Brdu免疫熒光雙標(biāo)):Brdu陽性細(xì)胞大多同時(shí)表達(dá)成熟神經(jīng)元的標(biāo)記物(Noun),很少與星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物(GFAP)有共存現(xiàn)象。P14日齡大鼠不管在SE發(fā)作后還是正常發(fā)

7、育中齒狀回Brdu陽性細(xì)胞同時(shí)表達(dá)NeuN的細(xì)胞數(shù)均在80％以上,兩組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),同時(shí)有4％-5％共表達(dá)GFAP,陰性對(duì)照組無免疫反應(yīng)產(chǎn)物。
　　 結(jié)論:1、癲癇持續(xù)狀態(tài)可促進(jìn)發(fā)育鼠海馬DG的神經(jīng)發(fā)生,而且神經(jīng)發(fā)生有年齡相關(guān)性。2、NSCs增殖需經(jīng)過數(shù)天的潛伏期,在癲癇發(fā)作后14天達(dá)高峰,并在3周-4周恢復(fù)正常。神經(jīng)發(fā)生的最初部位在顆粒下層,約1周-2周NSCs遷移到顆粒細(xì)胞層,同時(shí)也有門區(qū)和內(nèi)分子層異位遷