戊四氮誘導(dǎo)發(fā)育鼠癲

1、<p><b>　　戊四氮誘導(dǎo)發(fā)育鼠癲</b></p><p>　　【關(guān)鍵詞】 戊四 </p><p>　　摘要 :目的 探討戊四氮誘導(dǎo)發(fā)育鼠癲持續(xù)狀態(tài)（SE）后海馬結(jié)構(gòu)的突觸重建以及NMDA受體在其中的作用。 方法 利用圖像分析儀測(cè)定戊四氮誘導(dǎo)的發(fā)育鼠癲持續(xù)狀態(tài)模型及用NMDA受體拮抗劑MK-801治療后海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)CA3區(qū)及齒狀回內(nèi)分子層突觸素（p3

2、8）的陽性免疫反應(yīng)產(chǎn)物的光密度值（A）。 結(jié)果 不同日齡SD大鼠SE后海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)各部p38陽性免疫反應(yīng)產(chǎn)物光密度值較對(duì)照組顯著增加，尤以CA3區(qū)苔蘚纖維層和齒狀回分子層內(nèi)帶為甚;MK-801可顯著減少p38的表達(dá)。 結(jié)論 癲持續(xù)狀態(tài)后存在突觸重建現(xiàn)象，一方面是癲發(fā)作的結(jié)果，另一方面也可能是導(dǎo)致癲反復(fù)發(fā)作的分子學(xué)基礎(chǔ);在此過程中NMDA受體發(fā)揮著重要的作用。 </p><p>　　關(guān)鍵詞 :發(fā)育鼠;癲持續(xù)狀態(tài);

3、突觸素;齒狀回;MK-801 </p><p>　　Abstract:Objective To study the synaptic reorganization of hippocampal formation after pentylenetetrazol-induced sta-tus epilepticus in developing rats and the effect of NMDA recepto

4、r antagonist MK-801on it.Methods The optical density（A）of synaptophysin（p38）immunoreactive product was examined by image pattern analysis in the hippocampus of developing rats associated with pentylenetetrazol-induced st

5、atus epilepticus and MK-801treatment.Results The A of p38positive im-munoreactive product in hippo</p><p>　　Key words:developing rats;status epilepticus;synaptophysin;dentate gyrus;MK-801 </p><p&g

6、t;　　癲是最常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，是由于腦細(xì)胞的突然放電所引起反復(fù)性驚厥發(fā)作。其中癲持續(xù)狀態(tài)（status epilepticus，SE）因能夠造成嚴(yán)重的全身性和神經(jīng)元的損傷而受到重視。近年來，在不同的動(dòng)物癲模型及人類癲灶的形態(tài)學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)了突觸重建現(xiàn)象，被認(rèn)為是癲發(fā)生后中樞神經(jīng)系統(tǒng)可塑性變化的重要反映［1］ 。突觸素（synaptophysin，p38）系一相對(duì)分子質(zhì)量為38000的鈣結(jié)合糖蛋白，位于小突觸囊泡上，在神經(jīng)元胞體合成

7、后被轉(zhuǎn)運(yùn)至軸突終末貯存。p38作為突觸囊泡的一種特異標(biāo)志性蛋白，其密度和分布可間接反映體內(nèi)突觸的數(shù)量和分布情況，從而反映出突觸結(jié)構(gòu)和功能的變化，與突觸重建密切相關(guān)［2］ 。 </p><p>　　許多研究表明，成年大鼠在SE發(fā)作后海馬等結(jié)構(gòu)中存在明顯的突觸重建現(xiàn)象，而本研究建立不同年齡幼鼠戊四氮（pentylenetetrazol，PTZ）致SE模型，采用免疫組織化學(xué)方法動(dòng)態(tài)觀察p38在發(fā)育鼠海馬內(nèi)的表達(dá)，并研究

8、應(yīng)用非競(jìng)爭(zhēng)性N-甲基-D-天門冬氨酸受體拮抗劑MK-801對(duì)其表達(dá)的影響，以探討發(fā)育期致動(dòng)物海馬突觸功能、突觸重構(gòu)變化過程及NMDA受體在突觸重建中的作用。 </p><p><b>　　1 材料和方法 </b></p><p>　　1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和試劑 </p><p>　　1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠7天、14天、21天、28天4個(gè)

9、日齡組，雌雄不限，各組均為54只，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為癲持續(xù)狀態(tài)組（SE組）、MK-801治療組（MK-801組）和對(duì)照組（NS組），每組各6只。 </p><p>　　1.1.2 試劑 鼠抗p38單克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品;SP免疫組化染色試劑盒，美國(guó)ZYMED公司產(chǎn)品;PTZ、MK-801為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。 </p><p><b>

10、;　　1.2 方法 </b></p><p>　　1.2.1 癲持續(xù)狀態(tài)模型的建立和分組處理 各日齡大鼠的SE組與MK-801組腹腔內(nèi)注射PTZ（80mg.kg，用生理鹽水稀釋成100g.L），發(fā)作開始時(shí)的表現(xiàn)按Lado幼鼠癲發(fā)作分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［3］ 評(píng)價(jià)，均達(dá)到3.5～8級(jí)發(fā)作，呈癲持續(xù)狀態(tài)，發(fā)作1h2組均給予地西泮腹腔內(nèi)注射（10mg.kg）以終止發(fā)作，MK-801組給地西泮同時(shí)腹腔內(nèi)注射MK-801，

11、劑量為1mg.kg（用生理鹽水稀釋成0.5g.L）。各日齡大鼠NS組用與PTZ等體積的生理鹽水腹腔內(nèi)注射，1h后亦給予同劑量的地西泮腹腔注射。所有大鼠均在同一實(shí)驗(yàn)室和動(dòng)物中心操作和喂養(yǎng)，以保持喂養(yǎng)、光照、噪聲等條件相同，減少外界干擾造成的差異。 </p><p>　　1.2.2 組織切片的制備 4個(gè)日齡組分別于發(fā)作后第7、14、28天（每一時(shí)間點(diǎn)各組均為6只）腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛（0.35ml.kg）麻醉，4

12、%多聚甲醛左心灌注固定取腦。在海馬部位做連續(xù)冠狀冰凍切片，切片厚30μm，每隔2張取1張切片，每例標(biāo)本（雙側(cè)海馬結(jié)構(gòu)）取切片不少于8張。 </p><p>　　1.2.3 免疫組織化學(xué)染色 以鼠抗p38單克隆抗體（1∶100）作為一抗，采用SP法行p38免疫組織化學(xué)染色，用DAB和H 2 O 2 呈色，自來水沖洗，貼片，脫水，透明，封片。棕黃色著色為陽性。陰性對(duì)照試驗(yàn)以PBS代替一抗，其余染色步驟相同。 <

13、/p><p>　　1.2.4 結(jié)果判定 p38免疫反應(yīng)產(chǎn)物的標(biāo)記強(qiáng)度以光密度值（A）表示，應(yīng)用LEICA Qwin圖像處理與分析系統(tǒng)（德國(guó)）測(cè)定齒狀回分子層內(nèi)帶與海馬CA3區(qū)苔蘚纖維層等部位，每個(gè)部位測(cè)定10個(gè)視野的A值（分別為A1、A2……A10），同時(shí)測(cè)定同一張切片的胼胝體的A值（A 0 ）作為背景，計(jì)算出校正A值（CA值）:CA=（A1+A2+……+A10）.10-A 0 。每例標(biāo)本被檢各區(qū)測(cè)6張切片，該例標(biāo)本

14、的p38免疫反應(yīng)產(chǎn)物A值為各片CA的平均值。 </p><p>　　1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所得結(jié)果以ˉx±s表示，應(yīng)用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行顯著性差異分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn):α=0.05。 </p><p><b>　　2 結(jié)果 </b></p><p>　　2.1 行為學(xué)觀察 SE組與

15、MK-801組大鼠注射PTZ后1～2min進(jìn)入潛伏期，由自由活動(dòng)狀態(tài)逐漸轉(zhuǎn)為安靜、呼吸加快，很快出現(xiàn)癲發(fā)作，漸次出現(xiàn)連續(xù)點(diǎn)頭、前肢陣攣、后退、摔倒;7～8級(jí)發(fā)作的大鼠則表現(xiàn)為狂奔嘶叫、全身強(qiáng)直-陣攣性發(fā)作，同時(shí)伴有全身青紫。NS組大鼠無行為學(xué)改變。 </p><p>　　2.2 p38免疫反應(yīng)產(chǎn)物 </p><p>　　2.2.1 NS組 NS組切片的海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)p38免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈板層樣

16、分布，神經(jīng)氈內(nèi)免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈特異性點(diǎn)狀或顆粒狀沉積，多為細(xì)顆粒狀沉積，神經(jīng)元胞質(zhì)、膠質(zhì)細(xì)胞、血管及白質(zhì)不被染色。在海馬CA3區(qū)苔蘚纖維層內(nèi)，深染的顆粒狀免疫反應(yīng)產(chǎn)物較為均勻分布，整體呈月牙形（圖1A）。在齒狀回內(nèi)分子層內(nèi)帶染色最深，顆粒細(xì)胞輪廓邊緣也有點(diǎn)狀反應(yīng)產(chǎn)物沉積（圖1B）。陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)切片無特征性免疫反應(yīng)產(chǎn)物。各日齡組切片經(jīng)分析比較，14、21與28日齡鼠的p38的表達(dá)逐漸增加，且兩兩比較有顯著性差異（P&lt;0.05）

17、，但35、42、49、56日齡鼠較28日齡鼠均無顯著性差異（P&gt;0.05）。圖2示NS組不同日齡鼠p38的表達(dá)趨勢(shì)。 </p><p>　　圖1 海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)突觸素p38免疫反應(yīng)產(chǎn)物（略） </p><p>　　A:箭頭示CA3區(qū)苔蘚纖維層（免疫組化染色，×100）B:箭頭示齒狀回分子層內(nèi)帶（免疫組化染色，×40） </p><p>

18、;　　圖2 NS組不同日齡鼠p38的表達(dá)趨勢(shì)（略） </p><p>　　2.2.2 SE組與MK-801組 SE組海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)p38免疫反應(yīng)產(chǎn)物的分布特征無明顯變化。定量結(jié)果顯示，各日齡組在癲發(fā)作后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)海馬CA3區(qū)苔蘚纖維層、齒狀回分子層內(nèi)帶p38免疫反應(yīng)產(chǎn)物CA值顯著增加（P&lt;0.05），其中均以發(fā)作后14天增加達(dá)最高峰。 </p><p>　　MK-801組齒狀回

19、分子層內(nèi)帶及CA3區(qū)苔蘚纖維層p38免疫反應(yīng)產(chǎn)物CA值較各日齡SE組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著降低（P&lt;0.01），見表1。 </p><p>　　表1 3組大鼠海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)p38免疫反應(yīng)產(chǎn)物CA的比較（略） </p><p>　　與NS組比較:*P&lt;0.05，**P&lt;0.01;與PTZ組比較:#P&lt;0.05，##P&lt;0.01

20、</p><p><b>　　3 討論 </b></p><p>　　目前，對(duì)癲反復(fù)發(fā)作的病因的說法很多，但顆粒細(xì)胞的苔蘚纖維異常發(fā)芽及伴隨的突觸重建已被認(rèn)為是其細(xì)胞機(jī)制之一。即神經(jīng)系統(tǒng)因癲或其他因素作用受損后，現(xiàn)存的神經(jīng)元可通過軸突出芽形成不同的徑路與原有的突觸后位點(diǎn)或新的突觸后位點(diǎn)發(fā)生接觸，形成新的突觸。同時(shí)，平時(shí)處于休眠狀態(tài)的側(cè)支和突觸聯(lián)系被激活，從而完成神經(jīng)回

21、路的改造和突觸的重組，由此導(dǎo)致突觸可塑性發(fā)生變化。 </p><p>　　p38于1985由Jahn等［4］ 從大鼠腦突觸囊泡中提取，它幾乎存在于所有神經(jīng)終末的突觸囊泡膜上，是一種重要的囊泡膜標(biāo)志蛋白，參與多種突觸相關(guān)活動(dòng)，如參與Ca 2+ 依賴性神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程，并與長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（long-term potentiation，LTP）的誘導(dǎo)與維持有關(guān)［5］ 。免疫組織化學(xué)顯示，顆粒樣p38免疫反應(yīng)產(chǎn)物基本上反映了

22、被檢區(qū)突觸的分布和密度。經(jīng)電鏡證實(shí)，光鏡下標(biāo)記的p38顆粒樣結(jié)構(gòu)實(shí)際上就是成簇的囊泡。由于p38含量與突觸密度呈正相關(guān)，因此借助圖像分析系統(tǒng)測(cè)量p38免疫產(chǎn)物的平均光密度值可推測(cè)突觸數(shù)量或密度，從而反映出突觸結(jié)構(gòu)和功能的變化，并達(dá)到在光鏡水平分析超微結(jié)構(gòu)的目的［6］ 。以往研究證明，正常大鼠中樞突觸發(fā)育過程主要在生后3周內(nèi)完成［7］ 。沈麗等［8］ 對(duì)大鼠海馬突觸發(fā)育可塑性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)大鼠海馬CA1區(qū)生后20天至30天突觸數(shù)目仍有所增長(zhǎng)

23、，說明CA1區(qū)突觸數(shù)目增殖可持續(xù)至生后1個(gè)月，但20天突觸較30天突觸幼稚。本試驗(yàn)結(jié)果顯示NS組28日齡幼鼠p38的表達(dá)較14、21日齡有顯著性差異（P&lt;0.01），但比較35、42、49、56日齡均無顯著性差異</p><p>　　由于膠質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)p38，因此實(shí)驗(yàn)所見的p38增加可能主要由于神經(jīng)元活動(dòng)所致。但是p38免疫活性增高的機(jī)制目前仍不十分清楚，許多研究表明癲過程中常伴有海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)選擇性神

24、經(jīng)元丟失［9］ ，神經(jīng)元的丟失可使下位突觸空缺，存活的神經(jīng)元的軸突在失去靶器官后，就會(huì)出現(xiàn)軸突的出芽和形成許多側(cè)支，填補(bǔ)丟失神經(jīng)元留下的空間，并與其他神經(jīng)元建立新的突觸聯(lián)系，構(gòu)成異常的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，因此其突觸前囊泡的數(shù)量可能增加，另外也可能與突觸前膜功能代償性增加有關(guān)。Chen等［10］ 在大鼠局部皮質(zhì)注射海人酸的腦區(qū)也發(fā)現(xiàn)p38免疫組化反應(yīng)增強(qiáng)和神經(jīng)元脫失，提示p38表達(dá)增強(qiáng)是神經(jīng)元損傷的結(jié)果。綜合既往研究，我們認(rèn)為SE發(fā)作與p38表達(dá)增

25、強(qiáng)之間關(guān)系可能為:①癲發(fā)作后大量Ca 2+ 內(nèi)流，激活了Ca 2+ .CaM依賴性蛋白激酶系統(tǒng)，促進(jìn)興奮性氨基酸釋放［11］，p38蛋白正是Ca 2+ .CaM依賴性蛋白激酶［12］ 。②驚厥后NMDA受體活性的增高，谷氨酸過量釋放后，一方面介導(dǎo)興奮毒性損害，導(dǎo)致神經(jīng)元壞死或凋亡;另一方面也啟動(dòng)了一些神營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)，特別是腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrop</p><p>　　本

26、試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SE發(fā)作后p38免疫反應(yīng)產(chǎn)物的增加一直持續(xù)到試驗(yàn)終點(diǎn)28天，推測(cè)海馬p38免疫反應(yīng)產(chǎn)物增加，一方面是癲發(fā)作的結(jié)果，另一方面也可能是癲慢性反復(fù)發(fā)作的分子病理學(xué)基礎(chǔ)?？紤]由于當(dāng)出芽側(cè)支回返時(shí)，可穿過顆粒細(xì)胞層到達(dá)齒狀回分子層或穿過CA3錐體細(xì)胞層到達(dá)CA3始層形成突觸聯(lián)系，海馬結(jié)構(gòu)的突觸調(diào)整，構(gòu)成了密亂的反復(fù)興奮環(huán)路，激動(dòng)信號(hào)在環(huán)路中不斷振蕩，自我放大和增強(qiáng)，可導(dǎo)致癲反復(fù)發(fā)作。NMDA受體是廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的谷氨酸敏感離子通

27、道受體，在癲的發(fā)生、發(fā)展和維持中起著重要的作用。它是一種具有許多不同變構(gòu)調(diào)控位點(diǎn)并對(duì)Ca 2+ 高度通透的配體門控離子通道，它不僅通過調(diào)節(jié)鈣離子內(nèi)流，保持神經(jīng)元正常的生理功能，同時(shí)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、可塑性密切相關(guān)，并參與缺氧缺血性腦損傷、癲和大腦退行性變等損傷的病理生理過程［17］ 。MK-801是一個(gè)強(qiáng)有力、非競(jìng)爭(zhēng)性的NMDA型受體拮抗劑，富親脂性，易于通過血腦屏障，能有效地、選擇性地作用于具有此受體的海馬神經(jīng)細(xì)胞，而且NMDA受

28、體上MK-801非競(jìng)爭(zhēng)性拮抗部位在不成熟大鼠比成年大鼠敏感［18］ 。MK-801結(jié)合于與受體耦聯(lián)的離子通道內(nèi)部，從而</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)動(dòng)態(tài)觀察了PTZ致癲持續(xù)狀態(tài)后海馬突觸素的改變，結(jié)果說明在生理狀態(tài)下SD大鼠腦內(nèi)p38在生后28天即達(dá)高峰;而SE發(fā)作后突觸素表達(dá)顯著增強(qiáng)，提示SE發(fā)作后海馬等結(jié)構(gòu)內(nèi)存在神經(jīng)元的突觸重建現(xiàn)象，因而這些結(jié)構(gòu)的神經(jīng)可塑性發(fā)生改變，并由此可能導(dǎo)致神經(jīng)生理功能的改變，繼而可能成

29、為癲反復(fù)發(fā)作的解剖基礎(chǔ)。 </p><p><b>　　參考文獻(xiàn) : </b></p><p>　?。?］ 羅煥敏.海馬結(jié)構(gòu)―――從形態(tài)、功能到可塑性、衰老性變化［J］.神經(jīng)解剖學(xué)雜志，1996，12（2）:177-184. </p><p>　?。?］ Proper EA，Oestreicher AB，Jansen GH，et al.Imm

30、unohistochemical characterization of mossy fibre sprouting in the hippocampus of patients with pharmaco-resistant temporal lobe epilepsy［J］.Brain，2000，123（Pt1）:19-30. </p><p>　?。?］ Lado FA，Sperber EF，Moshe S

31、L.Anticonvulsant efficacy of gabapen-tin on kindling in the immature brain［J］.Epilepsia，2001，42（4）:458-463. </p><p>　?。?］ Jahn R，Schiebler W，Duimet C，et al.A38，000-dalton membrane protein（p38）present in syna

32、ptic vesicles［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1985，82（12）:4137-4141. </p><p>　?。?］ Mullany PM，Lynch MA.Evidence for a role for synaptophysin in ex-pression of long-term potentiation in rat dentate gyrus［J］.Neurore

33、-port，1998，9（11）:2489-2494. </p><p>　?。?］ Masliah E，Terry RD，Alford M，et al.Quantitative immunohistoche-mistry of synaptophysin in human neocortex:an alternative method to estimate density of presynaptic ter

34、minals in paraffin sections［J］.J His-tochem Cytochem，1990，38（6）:837-844. </p><p>　　［7］ Nixdorf BE.Ultrastructural analysis of the development and maturation of synapses and subsynaptic structures in ectostri

35、atum of the zebra finch ［J］.J Comp Neurol，1989，290（4）:472-486. </p><p>　?。?］ 沈 麗，買鴻宴，南 燕，等.大鼠海馬突觸發(fā)育可塑性研究［J］.北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1999:31（3）:209-211. </p><p>　?。?］ Buckmaster PS，Dudek FE.Network properties o

36、f the dentate gyrus in epileptic rats with hilar neuron loss and granule cell axon reorganization［J］.Neurophysiol，1997，77（5）:2685-2696. </p><p>　?。?0］ Chen LS，Wong JG，Banerjee PK，et al.Kainic acid-induced fo

37、cal cortical seizure is associated with an increase of synaptophysin immu-noreactivity in the cortex［J］.Exp Neurol，1996，141（1）:25-31. </p><p>　?。?1］ Ikegaya Y，Nishiyama N，Matsuki N.L-type Ca 2+ channel block

38、er inhibits mossy fiber sprouting and cognitive deficits following pilo-carpine seizures in immature mice［J］.Neuroscience，2000，98（4）:647-659. </p><p>　　［12］ Rubenstein JL，Greengard P，Czerngk AJ.Calcium-depen

39、dent serine phosphorylation of synaptophsin ［J］.Synapse，1993，13（2）:161-172. </p><p>　?。?3］ 袁寶強(qiáng)，梁衛(wèi)蘭，李春英，等.c-fos基因在聽源性驚厥易感大鼠腦的表達(dá)―――原位雜交組織化學(xué)法研究［J］.神經(jīng)解剖學(xué)雜志，1994，10（3）:203-207. </p><p>　?。?4］ Smeyne

40、RJ，Vendrell M，Hayward M，et al.Continous c-fos expres-sion precedes programmed cell death in vivo［J］.Nature，1993，363（6453）:166-169. </p><p>　?。?5］ Morgan JI，Curran T.Proto-oncogene transcription factors and e

41、pi-lepsy［J］.Trends Pharmacol Sci，1991，12（9）:343-349. </p><p>　?。?6］ Silva Brum IF，Elisabetsky E.Antiepileptogenic properties of pheno-barbital behavior and neurochemical analysis［J］.Pharmacol Biochem Behav，2

42、000，67（3）:411-416. </p><p>　?。?7］ Liu Y，Zhang J.Recent development in NMDA receptors［J］.Chin Med J，2000，113（10）:948-956. </p><p>　?。?8］ Mares P，Velisek L.N-methyl-D-aspartate（NMDA）-induced seizu