ILDR1及ILDR2調(diào)控內(nèi)耳基因可變剪接功能的初步探討.pdf

1、聽力損失是影響世界上上億人的最普遍的感官性疾病之一，其中50％以上是由遺傳基因的突變或缺失引起的。截止到2015年，已經(jīng)鑒定了141個(gè)與非綜合征聽力損失(NSHL)相關(guān)的基因位點(diǎn)，其中85個(gè)基因已被確定為耳聾基因。在新的測序技術(shù)幫助下，如大規(guī)模并行測序(MPS)和下一代測序分析(NGS)，預(yù)計(jì)會(huì)發(fā)現(xiàn)更多的耳聾基因。
　　Ildr1基因的突變會(huì)引起常染色體隱性耳聾DFNB42。ILDR1屬于Ⅰ型跨膜蛋白，其結(jié)構(gòu)包括胞外免疫球蛋白(I

2、g)樣結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和胞內(nèi)段結(jié)構(gòu)域。ILDR1屬于進(jìn)化保守的Angulin蛋白家族，它有兩個(gè)同源蛋白，ILDR2和LSR。這三個(gè)蛋白均定位于細(xì)胞緊密連接(TJ)處，對(duì)細(xì)胞緊密連接的形成是非常重要的。Ildr1敲除小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的聽力損失并伴隨出生后的耳蝸毛細(xì)胞變性。在小鼠內(nèi)耳中，毛細(xì)胞以及支持細(xì)胞中都可以檢測到Ildr1mRNA的表達(dá)，蛋白水平上也顯示ILDR1蛋白定位于細(xì)胞緊密連接(tTJs)。另一個(gè)緊密連接蛋白Tricellulin

3、也是細(xì)胞緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能所必需。Tricellulin基因突變可導(dǎo)致常染色體隱性聽力損傷DFNB49。ILDR1可以募集Tricellulin到細(xì)胞緊密連接處，而DFNB42相關(guān)的ILDR1突變蛋白卻喪失了這個(gè)功能。
　　除構(gòu)成緊密連接之外，有研究表明ILDR1可以介導(dǎo)脂肪刺激的膽囊收縮素(CCK)分泌，提示ILDR1可能作為一個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)受體調(diào)節(jié)CCK的分泌過程。然而，除了調(diào)節(jié)細(xì)胞緊密連接之外，ILDR1的其他生物學(xué)功能仍然是

4、未知的。
　　可變剪接將前體mRNA的外顯子以不同的排列方式拼接在一起，產(chǎn)生不同的成熟mRNA，最終產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和功能上不同的蛋白質(zhì)亞型?？勺兗艚尤毕菀鸢ǘ@在內(nèi)的各種類型的疾病。Transformer2protein homolog alpha(TRA2A),transformer2protein homolog beta(TRA2B)和serine/arginine-rich splicing factor1(SRSF1)都屬

5、于SR蛋白家族成員。TRA2A和TRA2B是果蠅Tra-2（最早發(fā)現(xiàn)的SR蛋白）在哺乳動(dòng)物中的同源蛋白，而SRSF1是第一個(gè)被鑒定的哺乳動(dòng)物SR蛋白，這些蛋白都被證明在可變剪接中起重要作用。在本文中，試圖闡明ILDR1在調(diào)節(jié)細(xì)胞緊密連接之外的的其他功能。發(fā)現(xiàn)ILDR1可以結(jié)合剪接因子TRA2A，TRA2B和SRSF1，并調(diào)控下游靶基因的可變剪接。
　　擬解決的科學(xué)問題：
　　1)ILDR1是否具有構(gòu)成細(xì)胞緊密連接之外的其它功

6、能？
　　2)ILDR1能否調(diào)控基因可變剪接？
　　3)Ildr1基因敲除是否影響小鼠內(nèi)耳基因的可變剪接？
　　4)Angulin蛋白家族的其它成員是否也能調(diào)控基因可變剪接？研究方案及取得的研究成果
　　為了回答以上科學(xué)問題，首先利用酵母雙雜交篩選與ILDR1相互作用的蛋白。在得到的陽性克隆中發(fā)現(xiàn)了一系列剪接因子，即TRA2A，TRA2B和SRSF1。它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上具有一定的相似性，都屬于SR家族，具有RS結(jié)構(gòu)域和

7、RRM結(jié)構(gòu)域;功能上都可以調(diào)控基因的可變剪接。緊接著利用免疫共沉淀試驗(yàn)驗(yàn)證了ILDR1同這些剪接因子的相互作用，而且發(fā)現(xiàn)RS結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)了ILDR1同TRA2A，TRA2B和SRSF1的相互作用。在COS7細(xì)胞中，過表達(dá)TRA2A，TRA2B和SRSF1后，ILDR1可被TRA2A，TRA2B和SRSF1從細(xì)胞質(zhì)中拉入細(xì)胞核中，進(jìn)一步驗(yàn)證了這種相互作用。利用RT-PCR和原位雜交技術(shù)檢測了這三個(gè)剪接因子在小鼠內(nèi)耳中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)它們?cè)谛?/p>

8、鼠內(nèi)耳的基底膜和蝸軸中均有表達(dá)，尤其是TRA2B，在螺旋神經(jīng)節(jié)處有高表達(dá)。這三個(gè)基因的表達(dá)在小鼠內(nèi)耳中P15至P30時(shí)達(dá)到高峰，并且呈現(xiàn)一定的互補(bǔ)模式。
　　TRA2A，TRA2B和SRSF1作為剪接因子可以調(diào)控基因的可變剪接，所以接下來進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)ILDR1是否通過結(jié)合這些轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)而調(diào)控剪接。在體外轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，TRA2B（或SRSF1）可以促進(jìn)TUBD1的4號(hào)外顯子、IQCB1的12號(hào)外顯子和Pcdh19小基因的

9、2號(hào)外顯子的可變剪接效率，而過表達(dá)ILDR1后抑制了這些基因的剪接，說明ILDR1在調(diào)控基因的可變剪接中確實(shí)發(fā)揮一定的作用。但是在動(dòng)物組織水平上，卻并沒有發(fā)現(xiàn)上述基因在野生型小鼠和Ildr1基因敲除小鼠中有明顯的可變剪接的變化。還收集了野生型小鼠和Ildr1基因敲除小鼠耳蝸基底膜的RNA進(jìn)行RNA-seq測序，同樣未發(fā)現(xiàn)有明顯的可變剪接變化的基因。推測ILDR1作為Angulin蛋白家族成員，它的兩個(gè)同源蛋白(ILDR2和LSR)有可能

10、代償了ILDR1的部分功能。利用RT-PCR和Q-PCR發(fā)現(xiàn)Ildr2在Ildr1敲除小鼠的內(nèi)耳基底膜中有明顯的升高趨勢，而Lsr的變化并不明顯。同樣的原位雜交試驗(yàn)也驗(yàn)證了這種變化趨勢。
　　接下來檢驗(yàn)了ILDR2能否在調(diào)控剪接方面有與ILDR1類似的作用。首先利用免疫共沉淀試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ILDR2和LSR都可以同TRA2A，TRA2B和SRSF1相互作用，免疫共聚焦檢測熒光時(shí)發(fā)現(xiàn)[LDR2在TRA2A，TRA2B和SRSF1存在時(shí)可被

11、從細(xì)胞質(zhì)中拉入細(xì)胞核里，同ILDR1的結(jié)果是一致的，而LSR卻仍保留在細(xì)胞質(zhì)中。緊接著通過在細(xì)胞水平上過表達(dá)ILDR1//ILDR2或LSR后，發(fā)現(xiàn)ILDR2同ILDR1一樣，抑制了基因的可變剪接效率，而LSR卻并沒有明顯的改變基因的可變剪接效率。最后，利用siRNA在培養(yǎng)的HEK293T細(xì)胞中單獨(dú)或共敲低內(nèi)源性ILDR1和ILDR2的表達(dá)，并檢測其對(duì)可變剪接效率的影響。結(jié)果顯示，siRNA作用后，ILDRI以及ILDR2表達(dá)水平都有明

12、顯下降，siRNA的抑制作用都在50％以上，并且干擾效果都比較特異，相互之間沒有影響。RT-PCR檢測靶基因的結(jié)果表明，TUBD1和IQCB1的可變剪接效率在ILDR1或ILDR2敲低細(xì)胞中受到了改變。當(dāng)siRNA同時(shí)下調(diào)ILDR1和ILDR2的表達(dá)時(shí)，TUBD1和IQCB1的可變剪接在更大程度上發(fā)生改變。該結(jié)果更進(jìn)一步驗(yàn)證了ILDR1和ILDR2蛋白在可變剪接調(diào)節(jié)中的作用。
　　創(chuàng)新性及意義：
　　本論文以ILDR1為研究

13、對(duì)象，對(duì)耳聾基因Ildr1在調(diào)控細(xì)胞緊密連接之外的生物學(xué)功能進(jìn)行了探討。得到的創(chuàng)新性研究成果及意義主要有以下兩點(diǎn):
　　1.以Ildr1基因?yàn)檠芯繉?duì)象，利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)ILDR1可以與TRA2A、TRA2B和SRSF1一系列剪接因子相互作用，并調(diào)控下游靶基因的可變剪接。
　　2.發(fā)現(xiàn)Ildr1基因敲除小鼠中基因可變剪接并未受到影響，同時(shí)在敲除小鼠中Ildr2的表達(dá)量明顯升高。過表達(dá)和敲低試驗(yàn)都表明了ILDR2在調(diào)控剪接方面