尼古丁通過激活大麻素受體減輕Aβ1-42所致神經(jīng)損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性的學(xué)習(xí)和認(rèn)知功能減退。研究表明，AD發(fā)生認(rèn)知功能減退的重要原因之一是腦內(nèi)β-淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用，過量的Aβ可損傷神經(jīng)元和激活小膠質(zhì)細(xì)胞。因此，降低Aβ的神經(jīng)毒性是防治AD的主要方法之一。一些流行病學(xué)研究顯示，吸煙人群 AD發(fā)病率明顯低于非吸煙人群，提示煙草中的主要成分尼古丁可能具有抗Aβ所

2、致的神經(jīng)損傷作用，但其作用機(jī)制尚未完全闡明。
　　大量文獻(xiàn)證明，激活腦內(nèi)大麻素（cannabinoid，CB）系統(tǒng)具有神經(jīng)保護(hù)作用。大麻素CB1受體激活后可保護(hù)神經(jīng)元，大麻素CB2受體激活可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化。此外，饒有興味的是，大麻素受體拮抗劑可用于治療尼古丁成癮，天然大麻素四氫大麻酚（tetrahydrocannabinol，THC）也可減輕尼古丁戒斷癥狀。上述證據(jù)提示，尼古丁的部分生物學(xué)效應(yīng)可能通過大麻素受體介導(dǎo)。

3、>　　本實(shí)驗(yàn)我們將神經(jīng)元細(xì)胞系HT22細(xì)胞暴露于Aβ1-42，建立Aβ神經(jīng)元損傷模型，觀察尼古丁對(duì)HT22細(xì)胞的保護(hù)作用；采用Aβ1-42刺激小膠質(zhì)細(xì)胞系N9細(xì)胞，建立Aβ小膠質(zhì)細(xì)胞激活模型，觀察尼古丁抑制N9細(xì)胞過度活化的作用；并對(duì)大麻素受體和PKC（protein kinase C，PKC）在其中的作用進(jìn)行探索。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，CB1受體介導(dǎo)了尼古丁保護(hù)HT22細(xì)胞抗Aβ1-42損傷；CB2受體介導(dǎo)了尼古丁抑制Aβ1-42引起的N

4、9細(xì)胞激活；尼古丁通過大麻素受體產(chǎn)生的神經(jīng)保護(hù)作用需要PKC的參與。由于煙草戒斷研究中發(fā)現(xiàn)小劑量尼古丁制劑（如電子香煙、尼古丁貼片）具有低毒性、低成癮性等優(yōu)點(diǎn)，本研究的結(jié)果將為探明尼古丁的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制和拓寬尼古丁的可能臨床適應(yīng)癥提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)，也為AD的治療方法提供了新思路。
　　第一部分大麻素CB1受體介導(dǎo)尼古丁保護(hù)神經(jīng)元的研究
　　實(shí)驗(yàn)一尼古丁對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用觀察
　　目的：Aβ神經(jīng)元損傷模型的建立和尼古丁（n

5、icotine，Nico）最佳保護(hù)濃度的確定。
　　方法：將HT22細(xì)胞分為對(duì)照組和1、5、10μM的Aβ1-42損傷組，孵育24 h后，用噻唑藍(lán)（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）方法以檢測細(xì)胞活力。隨后，將HT22細(xì)胞分為6組，分別為對(duì)照組、5μM的Aβ1-42損傷組和不同濃度（1、10、100和500μM）的尼古丁保護(hù)組，孵育24 h后，MTT法檢測細(xì)胞活力。
　　結(jié)果：5μ

6、M的Aβ1-42損傷24 h，可降低HT22細(xì)胞活力至對(duì)照組的60％左右，選擇5μM作為Aβ1-42的損傷濃度進(jìn)行隨后實(shí)驗(yàn)。100μM的尼古丁，可顯著恢復(fù)細(xì)胞活力，選擇100μM的尼古丁進(jìn)行隨后機(jī)制研究。
　　結(jié)論：我們選擇5μM Aβ1-42建立神經(jīng)元損傷模型，使用100μM尼古丁研究其保護(hù)機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)二 CB1受體介導(dǎo)尼古丁對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用
　　目的：觀察大麻素CB1受體在尼古丁保護(hù)HT22細(xì)胞中的作用。

7、r>　　方法：將HT22細(xì)胞分為5組，分別為空白對(duì)照組（Control）、Aβ?lián)p傷組、Nico保護(hù)組、CB1拮抗劑AM251干預(yù)組和AM251對(duì)照組。孵育24 h，MTT法檢測細(xì)胞活力、比色法檢測培養(yǎng)基內(nèi)乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)含量、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率、Western blot觀測CB1蛋白和凋亡相關(guān)蛋白Bcl2、Bax表達(dá)。
　　結(jié)果：與Aβ?lián)p傷組比較，Nico保護(hù)組細(xì)胞活力增加（P<

8、0.05），LDH釋放減少（P<0.05），細(xì)胞凋亡率降低（P<0.05），CB1和Bcl2表達(dá)上調(diào)（P<0.05），Bax表達(dá)下調(diào)（P<0.05）。CB1拮抗劑AM251顯著逆轉(zhuǎn)了尼古丁的上述作用（P<0.05）。
　　結(jié)論：CB1受體介導(dǎo)了尼古丁對(duì)HT22細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　實(shí)驗(yàn)三 PKC在尼古丁保護(hù)神經(jīng)元中的作用
　　目的：觀察PKC在尼古丁保護(hù)HT22細(xì)胞中的作用。
　　方法：將HT22細(xì)胞分為5組，分

9、別為空白對(duì)照組（Control）、Aβ?lián)p傷組、Nico保護(hù)組、CB1拮抗劑AM251干預(yù)組和AM251對(duì)照組。采用Western blot測定細(xì)胞膜上和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)PKC蛋白表達(dá)，計(jì)算二者比值，檢測PKC激活程度。隨后，將HT22細(xì)胞分為5組，分別為空白對(duì)照組、Aβ?lián)p傷組、Nico保護(hù)組、PKC抑制劑白屈菜紅堿（chelerythrine，Che）干預(yù)組和Che對(duì)照組。處理24 h，采用相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，MTT法測定細(xì)胞活力，并檢測L

10、DH釋放量。
　　結(jié)果：與Aβ?lián)p傷組相比，Nico保護(hù)組PKC激活水平顯著升高（P<0.05）；CB1拮抗劑AM251逆轉(zhuǎn)了尼古丁的上述作用（P<0.05）。與Aβ?lián)p傷組相比，Nico保護(hù)組細(xì)胞形態(tài)改善，細(xì)胞活力增加，LDH釋放減少（P<0.05）；PKC抑制劑Che逆轉(zhuǎn)了尼古丁的上述作用（P<0.05）。
　　結(jié)論： PKC作為CB1受體信號(hào)下游介導(dǎo)了尼古丁對(duì)HT22細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　第二部分大麻素CB2受體介導(dǎo)

11、尼古丁抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化的研究
　　實(shí)驗(yàn)一尼古丁抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活作用觀察
　　目的：建立Aβ小膠質(zhì)細(xì)胞激活模型和確定尼古丁最佳作用濃度。
　　方法：將N9小膠質(zhì)細(xì)胞分為對(duì)照組（Control）和1、2.5、5、10μM的Aβ1-42刺激組。處理24 h，采用Western blot檢測細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）蛋白表達(dá)水平。隨后，將N9小膠質(zhì)細(xì)胞

12、分為6組，分別為對(duì)照組、5μM的Aβ1-42刺激組和不同濃度（1、10、100、500μM）的尼古丁處理組，24 h后，ELISA法檢測培養(yǎng)基內(nèi)TNF-α和IL-6含量。
　　結(jié)果：5μM的Aβ1-42顯著上調(diào)N9細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)(P<0.05)。100μM的Nico顯著降低N9細(xì)胞TNF-α和IL-6釋放量(P<0.05)。
　　結(jié)論：我們選擇5μM Aβ1-42建立小膠質(zhì)細(xì)胞激活模型，使用100μM尼古丁研究其抑制N

13、9細(xì)胞活化的機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)二尼古丁減輕小膠質(zhì)細(xì)胞激活的機(jī)制研究
　　目的：探討尼古丁減輕N9小膠質(zhì)細(xì)胞活化的機(jī)制。
　　方法：將N9細(xì)胞分為5組，分別為空白對(duì)照組（Control）、Aβ?lián)p傷組、Nico處理組、CB2拮抗劑AM630干預(yù)組和AM630對(duì)照組，孵育24 h，采用Western blot、免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測 CB2、iNOS、精氨酸酶-1（arginase1，Arg-1）蛋白表達(dá)；采用ELISA法測量培養(yǎng)

14、基內(nèi) TNF-α、IL-6、IL-10和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）的濃度。隨后，將N9小膠質(zhì)細(xì)胞分為Control組、Aβ?lián)p傷組、Nico處理組、PKC抑制劑Che干預(yù)組和Che對(duì)照組，孵育24 h，檢測培養(yǎng)基內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-10和BDNF濃度。
　　結(jié)果：與Aβ?lián)p傷組比較，Nico處理組細(xì)胞iNOS表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，Arg-1表達(dá)上調(diào)(