異氟醚引起APP-PSEN1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷的神經(jīng)源性炎癥機(jī)制研究.pdf

1、目的：采用具有學(xué)習(xí)記憶損傷的阿爾茨海默氏病模型小鼠 APP/PSEN1轉(zhuǎn)基因小鼠模型，以APP/PSEN1小鼠及同窩對(duì)照野生型（wild type, WT）小鼠為工具，通過長時(shí)程異氟醚（isoflurane, ISO）吸入處理方式，研究異氟醚吸入對(duì)阿爾茨海默氏?。ˋlzheimer＇s disease, AD）模型小鼠疾病進(jìn)展過程中不同時(shí)期學(xué)習(xí)記憶能力、腦內(nèi)病理改變及伴隨不同時(shí)期學(xué)習(xí)記憶損傷時(shí)異氟醚對(duì)腦內(nèi)炎癥細(xì)胞及神經(jīng)前體細(xì)胞增殖的影響

2、，研究異氟醚APP/PSEN1小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞激活表型的影響，探討異氟醚調(diào)控腦內(nèi)不同炎癥狀態(tài)變化參與調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶損傷的過程，為AD等神經(jīng)源性炎癥相關(guān)疾病及老齡化患者的臨床麻醉用藥安全性提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.通過新奇物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)異氟醚處理對(duì)4、6、10月齡（發(fā)病前、發(fā)病早、中晚期）APP/PSEN1小鼠及對(duì)照組 WT小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響；實(shí)驗(yàn)共分四組：吸氧處理的野生型小鼠WT

3、+CON組及AD模型小鼠APP/PSEN1+CON組、吸醚處理的野生型小鼠WT+ISO組及AD模型小鼠APP/PSEN1+ISO組。
　　2.行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，利用剛果紅染色實(shí)驗(yàn)方法觀察APP/PSEN1小鼠皮層和海馬區(qū)（hippocampus,HIP）淀粉樣斑塊沉積數(shù)目的變化。
　　3.通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)方法觀察APP/PSEN1小鼠及其對(duì)照組WT小鼠的腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物鈣離子結(jié)合受體蛋白1（ionized calcium

4、-binding receptor adapter molecular1，Iba1）和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）免疫反應(yīng)性變化。
　　4.通過實(shí)時(shí)定量 PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction,）技術(shù)檢測(cè) APP/PSEN1小鼠及對(duì)照組 WT小鼠前額葉皮層（prefrontal co

5、rtex, PFC）和海馬區(qū) M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物白介素-6(interleukin-6, IL-6)、腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）和M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物幾丁質(zhì)酶3樣蛋白(Chitinase-3 like protein,Ym1/2)的mRNA表達(dá)水平的變化。
　　5.通過抗溴脫氧

6、尿嘧啶核苷（bromodeoxyuridine, BrdU）免疫組化實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)APP/PSEN1小鼠及對(duì)照組WT小鼠海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力的變化。
　　結(jié)果：
　　1.新奇物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中，吸醚處理前，與野生型WT小鼠相比，4月齡 APP/PSEN1轉(zhuǎn)基因小鼠新奇物體識(shí)別指數(shù)(RI)無差異，6月齡 APP/PSEN1小鼠RI有下降趨勢(shì)（P=0.051），而10月齡APP/PSEN1小鼠RI則顯著降低（P<0.05），提示6

7、月齡 APP/PSEN1小鼠有非空間學(xué)習(xí)記憶能力損傷的趨勢(shì)、10月齡APP/PSEN1小鼠已經(jīng)出現(xiàn)顯著非空間學(xué)習(xí)記憶能力損傷。隨后對(duì)不同月齡兩組小鼠分別進(jìn)行長時(shí)程的吸氧和吸醚處理。新奇物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與經(jīng)吸氧處理的WT小鼠(WT+CON)組相比，4月齡經(jīng)吸醚處理的WT小鼠(WT+ISO)組RI未見明顯差異；與經(jīng)吸氧處理APP/PSEN1轉(zhuǎn)基因小鼠(APP/PSEN1+CON)組相比，4月齡經(jīng)吸醚處理的APP/PSEN1轉(zhuǎn)基因小鼠(

8、APP/PSEN1+ISO)組 RI未見明顯差異。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示長時(shí)程的吸氧和吸醚處理后各組上臺(tái)潛伏期和穿臺(tái)次數(shù)均無明顯差異。新奇物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與WT+CON組相比，6月齡 APP/PSEN1+CON組 RI顯著降低（P<0.05）；與APP/PSEN1+CON組相比，6月齡 APP/PSEN1+ISO組 RI明顯降低（P<0.05）；與 WT+CON組相比，6月齡 WT+ISO組 RI未見差異。Morris水迷

9、宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與WT+CON組相比,6月齡APP/PSEN1+CON組上臺(tái)潛伏期升高（P<0.05）、穿臺(tái)次數(shù)顯著降低（P<0.01）；與APP/PSEN1+CON組相比，APP/PSEN1+ISO組穿臺(tái)次數(shù)明顯降低（P<0.01）；與WT+CON組相比，6月齡WT+ISO組穿臺(tái)次數(shù)未見差異。新奇物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與 WT+CON組相比，10月齡 APP/PSEN1+CON組 RI顯著降低（P<0.05）；與WT+CON組相比， WT

10、+ISO組RI顯著降低（P<0.05）；與APP/PSEN1+CON組相比，10月齡APP/PSEN1+ISO組RI未見差異。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與WT+CON組相比，10月齡APP/PSEN1+CON組上臺(tái)潛伏期顯著升高（P<0.01）、穿臺(tái)次數(shù)顯著降低（P<0.001）；與WT+CON相比， WT+ISO組穿臺(tái)次數(shù)顯著降低（P<0.01）；與APP/PSEN1+CON組相比，10月齡APP/PSEN1+ISO組穿臺(tái)次數(shù)未見

11、差異。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示長時(shí)程異氟醚吸入加重發(fā)病早期6月齡APP/PSEN1轉(zhuǎn)基因小鼠空間及非空間學(xué)習(xí)記憶損傷，對(duì)發(fā)病中晚期10月齡APP/PSEN1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷不明顯；同時(shí)，吸醚加重正常10月齡野生型WT小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷，對(duì)4月齡及6月齡正常WT小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷不明顯；
　　2.剛果紅染色實(shí)驗(yàn)中，長時(shí)程吸醚處理后，與 APP/PSEN1+CON組相比，6、10月齡APP/PSEN1+ISO小鼠皮層、海馬區(qū)剛果紅染色陽性

12、的淀粉樣斑塊未見顯著變化，提示異氟醚吸入對(duì)APP/PSEN1小鼠腦內(nèi)淀粉樣斑塊沉積無影響；
　　3.免疫熒光實(shí)驗(yàn)中，吸醚處理后，星型膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP免疫反應(yīng)結(jié)果顯示，與WT+CON組相比，6、10月齡APP/PSEN1+CON組皮層區(qū)GFAP免疫熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（P<0.01，P<0.001），海馬區(qū)有增強(qiáng)趨勢(shì)；與WT+CON組相比，6、10月齡WT+ISO組小鼠皮層及海馬區(qū)GFAP免疫熒光強(qiáng)度無變化（P>0.05）；與AP

13、P/PSEN1+CON組相比，6、10月齡 APP/PSEN1+ISO組小鼠皮層及海馬 GFAP免疫熒光強(qiáng)度無變化（P>0.05），提示吸醚處理對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞激活程度可能無顯著影響。小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba1免疫反應(yīng)結(jié)果顯示，與WT+CON組相比，6、10月齡APP/PSEN1+CON組小鼠皮層、海馬區(qū)內(nèi)Iba1免疫熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（P<0.05，P<0.01）；與APP/PSEN1+CON組相比，6月齡APP/PSEN1+ISO組小鼠皮

14、層及海馬Iba1免疫熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（P<0.05），10月齡APP/PSEN1+ISO組小鼠皮層及海馬Iba1免疫熒光強(qiáng)度未見明顯變化；與WT+CON組相比，6月齡WT+ISO組小鼠皮層及海馬區(qū)Iba1免疫熒光強(qiáng)度未見明顯變化，10月齡WT+ISO組小鼠皮層及海馬區(qū)Iba1免疫熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（P<0.05），提示長時(shí)程吸醚處理顯著調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞激活程度；
　　4.通過RT-qPCR實(shí)驗(yàn)，長時(shí)程吸醚處理后，與WT+CON組小鼠相比，

15、6、10月齡APP/PSEN1+CON組小鼠PFC、海馬內(nèi)IL-6、TNF-α、iNOS mRNA表達(dá)水平有不同程度升高。與 APP/PSEN1+CON組相比，6月齡APP/PSEN1+ISO組小鼠海馬腦區(qū)TNF-α、iNOS的mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.01，P<0.05），IL-6mRNA表達(dá)水平有升高的趨勢(shì)，在PFC有類似增加的趨勢(shì)；與WT+CON組相比，6月齡WT+ISO組PFC、海馬內(nèi)IL-6、TNF-α、iNOS mR

16、NA表達(dá)水平未見明顯差異。與APP/PSEN1+CON組相比，6月齡APP/PSEN1+ISO組小鼠PFC、海馬腦區(qū)M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Ym1/2的mRNA表達(dá)水平各組間無顯著差異，結(jié)果提示長時(shí)程吸醚處理促進(jìn)6月齡APP/PSEN1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)炎性因子表達(dá)水平增高，但對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞功能表型轉(zhuǎn)化無顯著影響。與WT+CON組相比，10月齡WT+ISO組小鼠PFC內(nèi)TNF-α的mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）， IL-6 mRNA表

17、達(dá)水平有升高的趨勢(shì)；與WT+CON組相比，10月齡WT+ISO組小鼠海馬腦區(qū)內(nèi) IL-6 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），TNF-α的mRNA表達(dá)水平有升高的趨勢(shì)。與 WT+CON組相比，10月齡 WT+ISO小鼠PFC腦內(nèi)M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Ym1/2 mRNA表達(dá)水平顯著下降（P<0.01），海馬腦區(qū)有類似的下降趨勢(shì)，提示長時(shí)程異氟醚吸入誘導(dǎo)10月齡野生型WT小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷可能與吸醚后促進(jìn)10月齡WT小鼠腦內(nèi)炎性因子釋

18、放，調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞M2/M1型功能表型的轉(zhuǎn)化密切相關(guān)；
　　5.BrdU免疫組化實(shí)驗(yàn)中，吸醚處理后，與WT+CON組相比，6月齡APP/PSEN1+CON組小鼠BrdU染色陽性細(xì)胞數(shù)目無顯著差異（P>0.05），10月齡 APP/PSEN1+CON組小鼠 BrdU染色陽性細(xì)胞數(shù)目顯著減少（P<0.001）。與APP/PSEN1+CON組相比，6月齡組APP/PSEN1+ISO組小鼠BrdU染色陽性細(xì)胞數(shù)目顯著減少（P<0.05）；

19、與WT+CON組相比，10月齡WT+ISO組小鼠BrdU染色陽性細(xì)胞數(shù)目有減少趨勢(shì)。提示異氟醚導(dǎo)致6月齡APP/PSEN1轉(zhuǎn)基因小鼠及10月齡WT小鼠海馬神經(jīng)前體細(xì)胞增殖能力損傷。
　　結(jié)論：長時(shí)程異氟醚吸入誘導(dǎo)發(fā)病早期APP/PSEN1轉(zhuǎn)基因小鼠的前額葉皮層相關(guān)非空間學(xué)習(xí)能力及海馬依賴的空間學(xué)習(xí)記憶能力損傷，對(duì)發(fā)病中晚期 APP/PSEN1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力損傷并不明顯，加重10月齡正常野生型小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷。研究發(fā)現(xiàn)異氟醚