microRNA在氯乙烯致大鼠DNA損傷和細(xì)胞周期改變中的作用.pdf

1、目的：
　　通過(guò)檢測(cè)亞慢性染毒氯乙烯（VCM）對(duì)大鼠肝臟細(xì)胞細(xì)胞周期時(shí)相分布的影響和大鼠外周血淋巴細(xì)胞DNA損傷情況，探討氯乙烯致癌過(guò)程中G1/S期監(jiān)測(cè)點(diǎn)功能變化以及致DNA損傷的劑量-反應(yīng)關(guān)系；檢測(cè)相關(guān)大鼠肝臟miRNAs表達(dá)水平改變，探討miRNAs在VCM致細(xì)胞周期改變中的作用，從分子水平探討氯乙烯致肝臟腫瘤的發(fā)病機(jī)制。
　　方法：
　　選用96只健康雄性SD大鼠，按體重隨機(jī)分成4組，每組24只，分別為對(duì)照組、V

2、CM低劑量(5mg/kg)、中劑量(25mg/kg)和高劑量(125mg/kg)三個(gè)劑量組。采用腹腔注射染毒，隔日染毒，每周3次。在染毒6、8、12周后分別隨機(jī)處死8只大鼠。
　　1．VCM致肝細(xì)胞遺傳毒性的研究：應(yīng)用彗星實(shí)驗(yàn)研究外周血淋巴細(xì)胞DNA損傷水平；應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)研究肝細(xì)胞細(xì)胞周期的改變。
　　2．肝細(xì)胞miR-199a-3p、miR-221、miR-222的表達(dá)水平：處死大鼠取其肝臟，提取total RNA并進(jìn)

3、行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)肝臟組織中上述miRNA的表達(dá)量，采用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　結(jié)果：
　　1．大鼠一般情況、體重變化及肝體比
　　大鼠在染毒期間一般情況和進(jìn)食均未見(jiàn)異常，各個(gè)組均未出現(xiàn)明顯中毒癥狀。各組動(dòng)物體重均呈正常的增長(zhǎng)趨勢(shì)，且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。8周和12周染毒結(jié)束時(shí)，各染毒組大鼠的肝體比均低于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　2．彗星實(shí)驗(yàn)研究

4、外周血淋巴細(xì)胞DNA損傷水平
　　VCM染毒8周后，高劑量組（125mg/kg）淋巴細(xì)胞尾部DNA含量百分比明顯高于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　VCM染毒12周后，與對(duì)照組相比， Olive尾距和尾長(zhǎng)各劑量組都明顯增高（P<0.05）；中劑量組（25 mg/kg）尾部DNA含量百分比低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　3．流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠肝臟細(xì)胞周期分布變化
　　VCM染毒

5、6周后，各染毒組大鼠肝細(xì)胞G1期百分比隨劑量的增加而呈上升趨勢(shì)，其中高劑量組（125mg/kg）的G1期分布百分比明顯高于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　VCM染毒8周后，低劑量組（5mg/kg）G1期分布百分比低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；低劑量組S期分布百分比高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　VCM染毒12周后， S期分布百分比隨劑量的升高而呈上升趨勢(shì)，高劑量組（125

6、mg/kg）S期分布百分比明顯高于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　4．實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)大鼠肝細(xì)胞miR-199a-3p、miR-221、miR-222的表達(dá)情況
　　VCM染毒6周后，大鼠肝臟組織miRNA-221和miRNA-222相對(duì)表達(dá)水平都隨著VCM染毒劑量的增加而呈下降的趨勢(shì)，高劑量組miRNA-221和miRNA-222相對(duì)表達(dá)量均明顯低于對(duì)照組（P<0.05）；與對(duì)照組相比，中劑量和高劑

7、量miRNA-199a-3p相對(duì)表達(dá)量均降低（P<0.05）。
　　VCM染毒8周后，低劑量組miRNA-221和miRNA-222相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；各個(gè)劑量組miRNA-199a-3p相對(duì)表達(dá)量隨著VCM染毒劑量的增加而呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　VCM染毒12周后，大鼠肝臟miRNA-221相對(duì)表達(dá)量隨著VCM染毒劑量的增加而呈上升的趨勢(shì)，低劑量組m

8、iRNA-221相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照相（ P<0.05）；miRNA-222相對(duì)表達(dá)量隨著VCM染毒劑量的增加而呈上升的趨勢(shì)，但與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；miRNA-199a-3p相對(duì)表達(dá)量隨著VCM染毒劑量的增加而呈上升的趨勢(shì)，低劑量組和中劑量組的miRNA-199a-3p相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組（P<0.05）。
　　5．大鼠肝臟細(xì)胞周期與miR-199a-3p、miR-221、miR-222表達(dá)水平的相關(guān)分

9、析
　　VCM染毒6周后，大鼠肝臟細(xì)胞miRNA-221、miRNA-222和miRNA-199a-3p的表達(dá)水平與G1期分布百分比呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r分別為0.6、0.44、0.51，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　VCM染毒8周后，大鼠肝臟細(xì)胞miRNA-221、miRNA-222和miRNA-199a-3p的表達(dá)水平與G1期和S期分布百分比均未呈現(xiàn)相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。
　　VCM染毒12周后，大鼠肝

10、臟細(xì)胞miRNA-221、miRNA-222和miRNA-199a-3p的表達(dá)水平與G1期分布百分比未呈現(xiàn)相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。大鼠肝臟細(xì)胞miRNA-221的表達(dá)水平與S期分布百分比呈現(xiàn)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.41，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；miRNA-222和miRNA-199a-3p的表達(dá)水平與S期分布百分比未呈現(xiàn)相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。
　　結(jié)論：
　　1．在本實(shí)驗(yàn)條件下，VCM染毒可導(dǎo)致大鼠外周血淋巴細(xì)