基于多重PCR靶向測序的乳腺癌易感基因BRCA1-2全外顯子區(qū)位點變異檢測.pdf

1、乳腺癌是女性中常見的一種癌癥，近年來中國乳腺癌的發(fā)生率和死亡率呈上升趨勢。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展受到遺傳、激素水平、生活習慣和環(huán)境等多種因素的影響，其中遺傳背景、年齡和性別是乳腺癌發(fā)生的高危因素，約5-10％的乳腺癌是遺傳性乳腺癌。與乳腺癌發(fā)生高度相關的易感基因主要是BRCA1和BRCA2基因，約15％的家族性乳腺癌與BRCA1/2基因突變相關。BRCA1/2基因是抑癌基因，能夠維持雙鏈DNA的穩(wěn)定性，BRCA1/2編碼區(qū)突變會升高患乳腺癌的

2、風險?；诙嘀豍CR的靶向測序技術是一種高效、經(jīng)濟、準確的測序方案，利用該技術對疾病易感基因的突變檢測已經(jīng)得到越來越廣泛的應用?；谵D(zhuǎn)座酶的建庫試劑盒具有高效、省時、起始DNA需求量低等優(yōu)勢。本論文利用多重PCR靶向富集BRCA1/2外顯子并結(jié)合基于轉(zhuǎn)座酶的建庫試劑盒建庫，利用二代測序平臺Illumina Hiseq2500系統(tǒng)對該DNA文庫進行突變位點檢測并對其測序結(jié)果進行應用分析，主要研究內(nèi)容分為以下三個部分:
　　1、設計靶

3、向富集BRCA1/2全外顯子的多重PCR引物及多重PCR反應條件優(yōu)化。研究共設計了58對引物覆蓋BRCA1/2外顯子和剪接位點區(qū)域，其中BRCA1引物25對和BRCA2引物33對，分別覆蓋基因長度17763bp和24383bp，擴增子長度在400-1500bp之間。BRCA1/2多重PCR反應總體系均為25μL，包括2×Premix Ex Taq HS(TaKaRa)12.5μL，模板DNA5ng，BRCA1混合引物(每條1μM)1μL

4、或BRCA2混合引物（每條1μM）4μL。反應條件:95℃預變性2min，94℃變性30s，56℃退火1min，72℃延伸2min，循環(huán)參數(shù)為22次，72℃終延伸10min。擴增后發(fā)現(xiàn)，BRCA1產(chǎn)物濃度高于BRCA2產(chǎn)物。
　　2、NGS測序文庫制備及生物信息學分析。為了確定最優(yōu)的NGS文庫制備方法，利用多重PCR和基于轉(zhuǎn)座酶建庫的方法制備了四組不同的比對文庫:1）BRCA1PCR文庫，2）BRCA2PCR文庫，3）BRCA1/

5、2PCR產(chǎn)物混合文庫及4）BRCA1/2引物混合PCR文庫（BRCA2∶BRCA1=4∶1，混合引物總量2pmol）。NGS測序及生物信息學分析結(jié)果顯示，這4種基于多重PCR靶向測序的方法，在1或2個多重PCR反應中可以捕獲BRCA1和BRCA2所有外顯子。這4種文庫的30×平均覆蓋度分別為100％、100％、99.94％和100％。在這4種文庫中，BRCA2外顯子平均測序深度和捕獲效率均高于BRCA1外顯子。應用多重PCR靶向測序的方

6、法對21例健康外周血全血樣本和2例乳腺癌腫瘤組織樣本的BRCA1/2外顯子進行測序，共檢出25個SNPs位點（其中1個BRCA1c.T5102A突變未被報道過）。未發(fā)現(xiàn)小片段的插入和缺失。4種方法檢出的SNPs位點經(jīng)Sanger測序驗證為真。這種基于多重PCR靶向測序的方法能夠用于臨床樣本BRCA1/2突變檢測。
　　3、應用基于多重PCR靶向測序的方法檢測乳腺癌樣本BRCA1和BRCA2基因全外顯子區(qū)變異。提取基因組DNA，應用

7、方法3）和4）制備12個乳腺癌外周血白細胞樣本的NGS文庫，檢測BRCA1和BRCA2基因全外顯子區(qū)突變。高通量測序結(jié)果顯示BRCA1/2所有外顯子均被捕獲，共檢出24個突變，其中有1例BRCA1致病突變rs80357303，該易感突變被報道會增加乳腺癌的發(fā)病風險。結(jié)合21個健康樣本對照分析，共檢出30個SNPs，其中7個SNPs包括rs28897689、rs55919657、rs118093942、rs11571707和rs80359

8、065、rs80357303（致病突變）和未報道的BRCA1c.T5102A突變僅出現(xiàn)在乳腺癌樣本中，3個SNPs包括rs1800062、rs80359785和rs80357127僅出現(xiàn)在健康樣本中。SNPs致病性預測結(jié)果顯示，未報道的BRCA1c.T5102A突變?yōu)榱夹裕鴕s80359065很可能是導致BRCA2蛋白有害突變。Sanger測序驗證進一步證實這種基于多重PCR靶向測序的方法在檢測BRCA1/2全外顯子區(qū)變異方面具有高的