解毒通絡(luò)方對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病心肌病變大鼠PPARγ-NF-κB-炎癥因子信號(hào)通路的干預(yù)研究.pdf

1、目的:
　　本課題提出“毒損心絡(luò)”是糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)的主要發(fā)病機(jī)制，為此，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用解毒通絡(luò)方通過整體和微觀兩種視角，以糖尿病心肌病變大鼠為研究對(duì)象，探究解毒通絡(luò)方對(duì)糖尿病心肌病變大鼠PPARγ-NF-κB信號(hào)通路及相關(guān)炎癥指標(biāo)的調(diào)控機(jī)制，驗(yàn)證“毒損心絡(luò)”是糖尿病心肌病的病機(jī)關(guān)鍵，豐富糖尿病心肌病的研究思路，為臨床治療糖尿病心肌病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1.

2、解毒通絡(luò)方對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病心肌病變大鼠治療作用及機(jī)制的在體實(shí)驗(yàn)研究
　　選取8周齡Wistar雄性大鼠100只（體重200g±20g/只），適應(yīng)喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成正常對(duì)照組8只和造模組92只。采用一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)55mg/kg制備糖尿病模型，各組繼續(xù)喂養(yǎng)1周后，測定隨機(jī)血糖(random blood glucose，RBG)，連續(xù)兩次隨機(jī)血糖＞16.7mmol/L，且伴有多尿、多飲、多食的大鼠判定是糖尿病建模成功

3、大鼠，共77只。給予常規(guī)飼料繼續(xù)喂養(yǎng)12周建立糖尿病心肌病變(DCM)模型，每周監(jiān)測各組大鼠RBG和體重(body weight，BW)，至12周末DCM成模大鼠共51只。將DCM模型大鼠隨機(jī)分為:解毒通絡(luò)方組、清熱解毒組、吡格列酮組、DCM模型對(duì)照組，分別灌胃給予解毒通絡(luò)方10.4g/(kg·d)，清熱解毒藥2.7g/(kg·d)，吡格列酮2.7mg/(kg·d)，DCM模型對(duì)照組和正常對(duì)照組給予等體積的蒸餾水，藥物干預(yù)時(shí)間為6周。第

4、18周末觀察并記錄大鼠一般狀態(tài);左心室插管測定大鼠左心室內(nèi)壓，分析心功能;稱重法測定大鼠心臟重量，計(jì)算心重指數(shù);經(jīng)腹主動(dòng)脈取血檢測血清中糖化血清蛋白(Glycosylated Serum Protein，GSP)、血脂、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α(TNF-α);赤道面橫切作常規(guī)石蠟病理切片進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)、Mass on染色、心肌糖原染色（PAS染色）、透射電鏡及免疫組化檢測

5、PPARγ、NF-κb的表達(dá);提取心肌組織mRNA行熒光定量PCR檢測PPARγ、TNF-α、IL-1β和IL-6基因的表達(dá);提取心肌組織蛋白行蛋白免疫印跡檢測PPARγ、NF-κb蛋白的表達(dá)情況。
　　2.解毒通絡(luò)方對(duì)高糖刺激H9c2心肌細(xì)胞PPARγ-NF-κb-炎癥因子通路的影響
　　用不同濃度葡萄糖刺激H9c2心肌細(xì)胞24小時(shí)和48小時(shí)，采用MTT法檢測不同葡萄糖濃度對(duì)H9c2心肌細(xì)胞的活力影響;采用MTT法檢測含藥

6、血清的藥理學(xué)評(píng)價(jià);根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用葡萄糖濃度為30mmol/L，含藥血清濃度為10％的培養(yǎng)液培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞，首先選擇3-4代H9c2心肌細(xì)胞，用葡萄糖濃度為30mmol/L，含10％胎牛血清的高糖培養(yǎng)液刺激培養(yǎng)24小時(shí)，24小時(shí)后藥物干預(yù)組給予葡萄糖濃度均為30mmol/L各組含藥血清濃度為10％的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)H9e2心肌細(xì)胞24小時(shí)，以含10％胎牛血清DMEM低糖培養(yǎng)液為正常對(duì)照組;采用Elisa法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中IL

7、-1β和TNF-α的含量;用RT-PCR法檢測心肌細(xì)胞內(nèi)TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA的表達(dá);采用Western blot檢測心肌細(xì)胞內(nèi)PPARγ、NF-κb蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.解毒通絡(luò)方對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病心肌病變大鼠治療作用及機(jī)制的在體實(shí)驗(yàn)研究
　?、俚?周、8周、12周時(shí)正常對(duì)照組和造模組之間空腹體重、隨機(jī)血糖、飲水量、飲食量和排尿量均有極顯著差異，造模組血糖逐周升高并維持在高水平，體重有逐周下

8、降趨勢;給藥后第13周、16周、18周，與正常對(duì)照組比較，DCM模型對(duì)照組體重極顯著降低，隨機(jī)血糖極顯著升高(P＜0.01);與DCM模型對(duì)照組比較，給藥后解毒通絡(luò)方組、清熱解毒組和吡格列酮組隨機(jī)血糖有降低的趨勢（P＜0.01），各組空腹體重?zé)o顯著差異（P＞0.05）。
　?、诘?8周末。飲水量、飲食量、排尿量結(jié)果:與正常對(duì)照組比較，DCM模型對(duì)照組飲水量、飲食量、排尿量極顯著升高（P＜0.01）;與DCM模型對(duì)照組比較，解毒通絡(luò)

9、方組、清熱解毒組和吡格列酮組的飲水量、飲食量、排尿量均顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）;心功能和心臟指數(shù)(H/W)檢測結(jié)果:與正常對(duì)照組比較，DCM模型對(duì)照組左心功能明顯下降，LVEDP、t-dp/dt均明顯升高，提示左室舒張功能障礙明顯，LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax明顯下降，提示左室收縮功能顯著下降，H/W明顯升高，提示心臟顯著增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）;與DCM模型對(duì)照組比較，解毒

10、通絡(luò)方組、清熱解毒組和吡格列酮組大鼠的心功能顯著改善，LVEDP、t-dp/dt均明顯降低（P＜0.05)，LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax明顯上升，H/W明顯降低(P＜0.01，P＜0.05);血清檢測血脂、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、糖化血清蛋白(GSP)以及IL-1β、TNF-α的結(jié)果:與正常對(duì)照組比較，DCM模型對(duì)照組血清中TG、TC、LDL-C、hs-CRP、GSP、IL-1β和TNF-α水平的顯著升高，H

11、DL-C顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）;與DCM模型對(duì)照組比較，解毒通絡(luò)方組、清熱解毒組和吡格列酮組血清中TG、TC、LDL-C、hs-CRP、GSP、IL-1β和TNF-α水平的顯著降低，HDL-C顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）;光鏡觀察左心室縱切片HE染色，正常對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰;DCM模型對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，心肌細(xì)胞肥大、扭曲，與DCM模型對(duì)照組比較，解毒通絡(luò)方治療組、清熱解毒治療組和吡格

12、列酮治療組，心肌細(xì)胞病理損傷有改善，心肌細(xì)胞排列較規(guī)則;光鏡觀察Masson染色，與正常對(duì)照組比較，DCM模型對(duì)照組細(xì)胞肥大變形，間質(zhì)纖維變粗增加，間質(zhì)纖維化明顯，解毒通絡(luò)方治療組、清熱解毒治療組和吡格列酮治療組間質(zhì)纖維略加粗，間質(zhì)纖維化有改善;PAS染色，與正常對(duì)照組比較，DCM模型對(duì)照組糖原容積分?jǐn)?shù)顯著升高;與DCM模型對(duì)照組比較，解毒通絡(luò)方組、清熱解毒組和吡格列酮組糖原容積分?jǐn)?shù)顯著降低;解毒通絡(luò)方組、清熱解毒組和吡格列酮組糖原容積

13、分?jǐn)?shù)無顯著差異(P＞0.05)。
　?、勖庖呓M化結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組比較，DCM模型對(duì)照組心肌組織PPARγ表達(dá)明顯下降、NF-κb表達(dá)顯著升高;與DCM模型對(duì)照組比較，解毒通絡(luò)方組、清熱解毒組和吡格列酮組心肌組織PPARγ表達(dá)顯著升高、NF-κb表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。
　?、躌T-PCR結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組比較，DCM模型對(duì)照組心肌組織PPARγmRMA表達(dá)明顯下降，TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA表達(dá)

14、顯著升高(P＜0.05);與DCM模型對(duì)照組比較，解毒通絡(luò)方組、清熱解毒組和吡格列酮組心肌組織PPARγmRMA表達(dá)明顯上升，TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA表達(dá)顯著下降（P＜0.05）。
　?、軼estern blot結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組比較，DCM模型對(duì)照組心肌組織PPARγ蛋白表達(dá)明顯下降、NF-κb蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）;與DCM模型對(duì)照組比較，解毒通絡(luò)方組、清熱解毒組和吡格列酮組心肌組織PPARγ蛋白

15、表達(dá)明顯上升、NF-κb蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.01）。
　　2.解毒通絡(luò)方對(duì)高糖刺激H9c2心肌細(xì)胞PPARγ通路的影響
　?、貳lisa法檢測結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α水平的顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）;與模型對(duì)照組比較，解毒通絡(luò)方組、清熱解毒組和吡格列酮組可細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α水平顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）。
　　②RT-PCR結(jié)

16、果顯示:與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組心肌細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05）;與模型對(duì)照組比較，解毒通絡(luò)方組、清熱解毒組和吡格列酮組心肌細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA表達(dá)顯著下降(P＜0.05)。
　?、踂estern blot結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組心肌細(xì)胞PPARγ蛋白表達(dá)明顯下降、NF-κb蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）;與模型對(duì)照組比較，解毒通

17、絡(luò)方組、清熱解毒組和吡格列酮組心肌細(xì)胞PPARγ蛋白表達(dá)明顯上升、NF-κb蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　1 解毒通絡(luò)方能夠改善實(shí)驗(yàn)性糖尿病心肌病變大鼠一般狀態(tài)，并具有調(diào)節(jié)糖、脂質(zhì)代謝及抗炎的作用;
　　2 解毒通絡(luò)方能夠降低實(shí)驗(yàn)性糖尿病心肌病變大鼠心臟指數(shù)，改善心功能，抑制心臟肥大、間質(zhì)纖維化和糖原沉積，具有保護(hù)心肌組織結(jié)構(gòu)和功能的作用;
　　3 解毒通絡(luò)方能明顯升高DCM大鼠心肌組織PP

18、ARγ基因和蛋白的表達(dá)，抑制DCM大鼠心肌組織NF-κB(p-p65)蛋白的表達(dá)及TNF-α、IL-1β和IL-6基因的表達(dá);
　　4 解毒通絡(luò)方能明顯上調(diào)高糖損傷H9c2心肌細(xì)胞PPARγ蛋白的表達(dá)，下調(diào)高糖損傷H9c2心肌細(xì)胞NF-κB(p-p65)蛋白的表達(dá)及TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA的表達(dá);
　　5 解毒通絡(luò)方防治DCM的作用機(jī)制可能與PPARγ-NF-κB-炎癥因子調(diào)控相關(guān)。
　　6 “毒損心絡(luò)