中性粒細(xì)胞胞外陷阱的糖皮質(zhì)激素調(diào)控與在感染性角膜炎中的觀察研究.pdf

1、研究背景：
　　感染性角膜炎是世界性的常見致盲眼病，具有發(fā)病率高，視力損害嚴(yán)重的特點。角膜感染的主要病原有細(xì)菌、真菌和病毒等。國內(nèi)外研究表明細(xì)菌性角膜炎主要病原菌主要是革蘭陽性球菌，以葡萄球菌最為常見，其次為革蘭陰性桿菌，以綠膿桿菌最為常見。感染性角膜炎的病理過程包括病原體的致病因子對角膜的毒性作用以及宿主識別病原體的入侵后啟動的防御反應(yīng)。中性粒細(xì)胞作為角膜抗感染固有免疫第一道防線，在角膜感染早期病原體的殺滅與炎癥控制及對病變發(fā)展

2、與預(yù)后具有關(guān)鍵作用。特別在細(xì)菌性角膜感染中，中性粒細(xì)胞遷移至炎癥部位，吞噬病原體，發(fā)生細(xì)胞內(nèi)呼吸爆發(fā)，產(chǎn)生活性氧類物質(zhì)并脫顆粒釋放抗菌肽殺傷病原體，同時產(chǎn)生各種炎癥介質(zhì)趨化更多的細(xì)胞浸潤擴大炎癥反應(yīng)，促進病原體的殺滅與清除，對于角膜早期感染的控制具有重大意義。最近發(fā)現(xiàn)一種稱之為中性粒細(xì)胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps，NETs）的新的中性粒細(xì)胞殺菌機制。所謂NETs是中性粒細(xì)胞在感染部位主動釋放大

3、分子DNA作為網(wǎng)狀支架，對病原菌進行包圍及限制，通過附著于DNA支架上的組蛋白和顆粒蛋白殺滅病原菌的過程。研究者在許多炎癥性疾病觀察到NETs的形成，認(rèn)為其在抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。如何通過調(diào)控NETs的形成來改變這些疾病的病變發(fā)展和預(yù)后成為人們研究的重點。
　　糖皮質(zhì)激素具有強大的抗炎作用，對許多慢性炎癥、過敏性、自身免疫性疾病的病變治療與病情緩解具有不可替代的作用。但糖皮質(zhì)激素可抑制抗感染免疫應(yīng)答，故在許多感染性疾病的臨床治

4、療中是否使用激素一直存在爭議。如何判斷糖皮質(zhì)激素使用的適應(yīng)癥，成為許多臨床醫(yī)生面臨的巨大挑戰(zhàn)。深入研究糖皮質(zhì)激素的免疫調(diào)控機制，對于臨床上合理選擇和使用藥物、制定更為有效的治療方案等具有重要的參考價值，以達到既能高效清除病原菌又能減少組織損傷的目的。
　　NETs作為感染免疫中的重要因素，其受糖皮質(zhì)激素的調(diào)控顯然也會影響到整個藥物使用對疾病的效應(yīng)。然而，NETs的體內(nèi)形成機制還未完全闡明，在眼部疾病中的研究更是屈指可數(shù)。本文我們主

5、要就糖皮質(zhì)激素對NETs的形成與殺菌率的干預(yù)作用以及NETs形成在感染性角膜炎發(fā)生發(fā)展中的作用加以研究。
　　研究方法：
　　本研究體外實驗部分采用分離自健康志愿者外周血的原代中性粒細(xì)胞及培養(yǎng)并誘導(dǎo)分化的人早幼粒白血病細(xì)胞系HL-60。金黃色葡萄球菌和經(jīng)典的NETs刺激物PMA用來誘導(dǎo)NETs形成。免疫熒光染色后顯微鏡下觀察NETs的形態(tài)。而地塞米松對NETs形成的干預(yù)主要通過sytox green染色與熒光顯微鏡拍照，胞外

6、游離DNA定量檢測（picogreen DNA檢測試劑盒）及細(xì)菌負(fù)荷率檢測方法來比較。實驗中數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用GraphPad Prism6.1軟件。
　　同時本研究采集了9例感染性角膜炎患者的角膜病灶組織刮片，予免疫熒光染色并熒光顯微鏡下觀察NETs的形成。結(jié)合患者的病史（發(fā)病時間，既往用藥）、病程、預(yù)后及檢驗科直接涂片鏡檢和刮片培養(yǎng)結(jié)果，分析NETs形成與角膜炎發(fā)生發(fā)展預(yù)后的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1、通過免疫熒光

7、染色法，我們驗證了金黃色葡萄球菌和PMA可以誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和分化的HL-60細(xì)胞形成NETs。這種新的細(xì)胞殺菌機制可以殺滅金黃色葡萄球菌。地塞米松預(yù)處理可以抑制金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞和分化的HL-60細(xì)胞的NETs形成并降低其殺菌效率;但對于PMA誘導(dǎo)的NETs形成，我們未觀察到地塞米松預(yù)處理產(chǎn)生顯著效應(yīng)。
　　2、感染性角膜炎患者病灶組織刮片免疫熒光染色可以檢測到NETs的存在。結(jié)合患者病史，發(fā)現(xiàn)NETs的形成影響病變的