PAK1-2-3和PLK1在惡性外周神經(jīng)鞘瘤中的作用及機制研究.pdf

1、惡性外周神經(jīng)鞘瘤(Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors，MPNST)是一種相對罕見的軟組織肉瘤，總發(fā)病率大約為十萬分之一。MPNST分為原發(fā)型和NF1繼發(fā)型，也有小部分發(fā)生于其他腫瘤的放射性治療過程中，其中NF1繼發(fā)型約占MPNST總數(shù)的50％。雖然，MPNST的發(fā)病率較低，但是其轉(zhuǎn)移性強，惡性程度高;發(fā)病早期，治療后復(fù)發(fā)率高;發(fā)病晚期，對化療藥物應(yīng)答性差，且病程進展迅速，死亡率較高，5年存活

2、率為35-50％。目前，手術(shù)切除是臨床治療MPNST的主要方法。但是，由于MPNST形態(tài)呈彌散性，邊緣模糊，且侵襲和轉(zhuǎn)移性強，給手術(shù)造成了極大困難。因此，迫切需要對MPNST進行靶向治療藥物的研究。
　　論文首次對MPNST進行了廣泛的、綜合性的藥物活性分析，篩選出對MPNST具有較高活性的化學(xué)藥物，以及潛在的藥物作用靶點。其次，根據(jù)藥物分析結(jié)果，對MPNST中兩種重要的激酶，也即重要的藥物作用靶點:p21活化激酶(PAK)和Po

3、lo樣激酶1(PLK1)進行了功能和作用機制研究。
　　第一部分 MPNST的高通量藥物活性分析
　　本部分研究首先建立高通量法對一種MPNST細胞(ST8814)進行了藥物活性分析，隨后以高通量藥物活性結(jié)果為基礎(chǔ)，選用一個對MPNST更具有針對性的高通量藥物集，包括與MPNST更加相關(guān)的小分子藥物，如MEK，RAF，RAS，F(xiàn)TI，PAK，ERK抑制劑，以及Wnt，Hedgehog，p53，EGF，HDAC通路中的一系列小

4、分子抑制劑，對MPNST細胞進行了藥物活性分析。同時，采用Spearman等級相關(guān)系數(shù)對分析方法和結(jié)果進行了一致性評價。最后，利用化學(xué)試劑誘導(dǎo)法和以上高通量藥物活性分析法進一步研究了MPNST產(chǎn)生MEK抑制劑耐藥性后，對抗腫瘤藥物的活性情況，具體研究結(jié)果如下:
　　(1)高通量藥物活性分析結(jié)果表明，MEK抑制劑、Pak抑制劑以及一些蛋白酶體抑制劑等對MPNST具有較高活性，同時發(fā)現(xiàn)一些尚未在MPNST中研究的藥物作用靶點，如Pol

5、o樣激酶，Aurora激酶，煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(NAMPT)等。
　　(2)對于數(shù)據(jù)庫間的一致性評價，我們測試了兩種來自其他大型數(shù)據(jù)庫的細胞株;對同種絀胞株，采用不同檢測方法:包括ATPLite法，氧化還原法或細胞核計數(shù)法測得的IC50進行了一致性評價。研究結(jié)果表明，影響一致性的因素有很多，包括細胞的培養(yǎng)條件，細胞存活率檢測方法，藥物的濃度范圍，藥物的儲存及統(tǒng)計方法等，其中運用不同的計算方法是一致性的最大影響因素。
　　(

6、3)成功誘導(dǎo)一株MPNST形成MEK耐藥性，且初步確認了一些在MEK抑制劑出現(xiàn)耐藥性情況下，仍具有較高活性的藥物，如Pak抑制劑，Brodomain抑制劑以及PI3K/mTOR抑制劑等。
　　通過以上研究，我們建立了MPNST的高通量藥物活性分析平臺，對MPNST細胞進行了綜合性的藥物活性分析，得到了對MPNST活性較高的藥物，如MEK抑制劑，Pak抑制劑，PLK1抑制劑和蛋白酶體抑制劑等。利用化學(xué)誘導(dǎo)法成功獲得MEK抑制劑耐藥M

7、PNST細胞株，并進行了藥物活性分析。
　　第二部分 Pak1/2/3在MPNST中的作用及機制研究
　　超過50％的MPNST與腫瘤抑制基因NF1的突變有關(guān)。NF1基因表達缺失導(dǎo)致Ras及其下游通路的激活，包括Raf/MEK/ERK和PI3K/AKT/mTOR信號通路，以及Wnt/β-catenin等通路。由于Pak可以調(diào)節(jié)Ras驅(qū)動的腫瘤的發(fā)生，因此，我們Pak激酶可能也參與MPNST的信號通路。
　　本研究中我們

8、利用免疫組化，Western Blot等方法檢測了Pak1/2/3在惡性外周神經(jīng)鞘瘤組織及細胞中的表達水平，并且通過抑制Pak1/2/3對其在MPNST中的作用機制進行了研究，結(jié)果表明，Pak1/2/3與人類惡性周圍神經(jīng)鞘瘤間具有很強的相關(guān)性，具體研究結(jié)果如下:
　　(1)免疫組化，Western Blot實驗結(jié)果顯示，Pak1/2/3在MPNST中的表達量顯著高于正常神經(jīng)細胞，且高于神經(jīng)纖維瘤，說明Pak1/2/3的表達水平與M

9、PNST的惡性程度具有相關(guān)性;
　　(2)MTS細胞增殖實驗，傷口愈合、普通Transwell小室實驗以及基質(zhì)膠侵襲實驗結(jié)果顯示，Pak抑制劑能夠降低MPNST細胞的增殖、遷移和侵襲能力;對Pak在MPNST中的作用機制研究表明，Pak主要通過Raf/Mek/Erk信號通路抑制MPNST的增殖，可能通過cadherin表達調(diào)控MPNST細胞的遷移和侵襲;
　　(3)通過轉(zhuǎn)錄因子分析我們發(fā)現(xiàn)，小分子Pak抑制劑IPA-3能夠下

10、調(diào)p53的表達，RT-PCR和熒光素酶實驗結(jié)果證明，Pak可能通過調(diào)控翻譯水平下調(diào)MPNST中的p53的表達;
　　(4)化學(xué)合成非ATP競爭性小分子Pak抑制劑IPA-3及其結(jié)構(gòu)類似物，并且在多種細胞中進行了活性分析，其中類似物Bis(2-naphthyl)disulfide活性明顯高于IPA-3，但是需要進一步對其進行結(jié)構(gòu)與功能的研究。
　　通過以上研究，我們發(fā)現(xiàn)Pak1/2/3在MPNST的增殖，遷移和浸潤過程具有重要

11、作用，且其表達量可以作為MPNST惡性程度的標志。
　　第三部分 PLK1在MPNST中的作用及機制研究
　　PLK1在細胞中有很多作用:控制有絲分裂起始點和G2/M期的檢查點，協(xié)調(diào)中心體與細胞周期，調(diào)節(jié)紡錘體組裝和染色體分離，在紡錘體中央?yún)^(qū)和脫落過程中發(fā)揮多種功能，以及促進DNA復(fù)制，參與細胞分裂和減數(shù)分裂等。研究證明，PLK1在人類的很多腫瘤中都具有高表達，通過抗體、干擾RNA或者激酶抑制劑阻斷PLK1的表達，能夠抑制腫

12、瘤細胞的增殖以及誘導(dǎo)細胞凋亡。目前，PLK1在MPNST中的表達以及抑制PLK1對MPNST細胞的影響尚未有人研究。因此，論文首次對PLK1在MPNST中的作用及機制進行了研究。
　　本研究首先通過基因芯片和Western Blot等方法檢測了PLK1在人和小鼠惡性外周神經(jīng)鞘瘤組織以及細胞中的表達。其次，利用MTS細胞增殖實驗，劃痕實驗，以及siRNA瞬時轉(zhuǎn)染等體外細胞學(xué)實驗，研究了PLK1在MPNST細胞增殖、遷移和侵襲中的作用

13、。最后，我們采用移植瘤小鼠，對PLK1在體內(nèi)的作用機制進行了研究，具體研究結(jié)果如下:
　　(1)高通量藥物活性分析中，PLK1抑制劑是對MPNST具有較高活性的藥物之一;
　　(2)我們通過人和小鼠的基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，PLK1在MPNST中表達量顯著高于神經(jīng)纖維瘤和正常神經(jīng)細胞;
　　(3)MTS和傷口愈合等體外實驗證明，PLK1抑制劑BI6727能夠降低MPNST的增殖和遷移能力，且與Aurora激酶抑制劑MLN82

14、37有明顯的協(xié)同作用;
　　(4)體內(nèi)實驗證明，PLK1抑制劑能夠降低小鼠MPNST移植瘤的增長速度。由于PLK1是細胞周期激酶，因此我們通過免疫組化實驗對移植瘤小鼠經(jīng)過BI6727治療后的腫瘤組織切片中的細胞周期標志物進行了分析。結(jié)果顯示，BI6727處理組腫瘤切片Ki67的染色細胞數(shù)明顯低于對照組，說明移植瘤小鼠經(jīng)過PLK1抑制劑處理后，腫瘤中活性細胞數(shù)降低;但是Cleaved Caspase3的水平無變化，說明沒有BI672

15、7并沒有誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡;BI6727對phospho-histone-3無影響，說明細胞可能發(fā)生G2-M期捕獲，同時CyclinB1（G2-M期的標志）水平升高，進一步證明BI6727能夠誘導(dǎo)細胞發(fā)生G2-M期捕獲，從而抑制細胞分裂。
　　以上研究表明，人和小鼠MPNST中PLK1表達量顯著升高，通過抑制細胞周期激酶PLK1能夠使細胞發(fā)生G2-M期阻斷，抑制細胞有些分裂，從而降低MPNST細胞的增殖和遷移，降低移植瘤小鼠的腫瘤增