miRNA-210及其靶基因EFNA3對(duì)惡性外周神經(jīng)鞘瘤(MPNST)的增殖和侵襲能力的機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　惡性外周神經(jīng)鞘瘤(MPNST)被認(rèn)為是起源于施旺細(xì)胞或神經(jīng)嵴細(xì)胞的多能細(xì)胞的罕見(jiàn)肉瘤。半數(shù)的MPNST的發(fā)生和1型神經(jīng)纖維瘤病(NF1)密切相關(guān)，NF1是一種良性外周神經(jīng)腫瘤，其發(fā)生率占總?cè)丝诘?.02％。盡管MPNST的發(fā)生率不高，但是MPNST在兒童的發(fā)生比例占所有軟組織肉瘤的4％到10％，并且通常都是致命的。對(duì)于MPNST的主要治療手段一般為手術(shù)治療，但是這種治療手段經(jīng)常不能完全切除腫瘤組織。而其它的治療手段包括

2、化療和放療的治療效果還不是很理想。因此，發(fā)展新的治療MPNST是目前臨床上繼續(xù)的。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子靶向治療被認(rèn)為是治療MPNST非常有前景且有效的治療手段。
　　小分子RNA(microRNA，miRNA)是一簇具有18-25個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的短小的非編碼RNA，主要通過(guò)促進(jìn)mRNA的降解或者翻譯抑制來(lái)參與對(duì)一系列人類(lèi)基因的表達(dá)抑制。MiRNA已經(jīng)被證明能夠調(diào)節(jié)許多細(xì)胞活動(dòng)，包括細(xì)胞增殖、分化、死亡和代謝等。異常表達(dá)的m

3、iRNA與癌癥發(fā)生和惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此對(duì)許多惡性腫瘤的診斷和預(yù)后具有極大的潛力。此外，積累的研究表明miRNA還能夠作為一種功能強(qiáng)大的工具用于治療許多惡性腫瘤。
　　MiRNA-210是目前為止發(fā)現(xiàn)最重要的一種miRNA，它參與了對(duì)細(xì)胞增殖、DNA修復(fù)、代謝和細(xì)胞遷移等細(xì)胞活動(dòng)。越來(lái)越多的數(shù)據(jù)表明miRNA-210是一種低氧或缺氧誘導(dǎo)的miRNA，并被缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)所調(diào)控。由于miRNA-210在低氧條件下被

4、HIF所調(diào)控，miRNA-210在許多中癌癥包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腎透明細(xì)胞癌、肺癌和乳腺癌等組織中表達(dá)上調(diào)。而且，miRNA-210被發(fā)現(xiàn)作為癌基因能夠通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲參與了癌癥的發(fā)生和發(fā)展。然而，直到目前，miRNA-210在MPNST中的作用和機(jī)制還不是很清楚。
　　因此，研究miRNA-210對(duì)MPNST細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響以及分析其潛在的分子機(jī)制將有助于理解MPNST的病理，并因此發(fā)展?jié)撛谥委烳PNST的

5、手段。
　　第一部分.MiRNA-210對(duì)MPNST增殖和侵襲的影響
　　目的:
　　(1).檢測(cè)miRNA-210在MPNST中的表達(dá)。
　　(2).研究miRNA-210在MPNST的增殖和侵襲中的作用。
　　方法和結(jié)果:
　　(1).通過(guò)Real-time PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miRNA-210在SK-N-SH細(xì)胞和MPNST細(xì)胞系包括ST88-14、sNF96.2、T265p21和YST-1的表達(dá)，

6、發(fā)現(xiàn)miRNA-210在ST88-14和sNF96.2細(xì)胞中表達(dá)極大的上調(diào)。
　　(2).分別轉(zhuǎn)染pre-miRNA-210、pre-con、anti-miRNA-210或anti-con進(jìn)入ST88-14和sNF96.2細(xì)胞中。通過(guò)MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相比于轉(zhuǎn)染對(duì)照，轉(zhuǎn)染pre-miRNA-210的ST88-14和sNF96.2細(xì)胞的細(xì)胞生存率和克隆形成效率明顯增加。相反，相比于對(duì)照，轉(zhuǎn)染anti-miRNA-210的ST

7、88-14和sNF96.2細(xì)胞的增殖和克隆形成效率下降了。
　　(3).流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果證明轉(zhuǎn)染pre-miRNA-210進(jìn)入ST88-14和sNF96.2細(xì)胞后能夠顯著的增加S期細(xì)胞。相反，轉(zhuǎn)染anti-miRNA-210進(jìn)入ST88-14和sNF96.2細(xì)胞后則顯著的減少了S期細(xì)胞。
　　(4).Transwell小室實(shí)驗(yàn)證明了轉(zhuǎn)染pre-miRNA-210進(jìn)入ST88-14和sNF96.2細(xì)胞后顯著增加了細(xì)胞侵襲能力。然

8、而，通過(guò)轉(zhuǎn)染anti-miRNA-210抑制ST88-14和sNF96.2細(xì)胞中內(nèi)源的miRNA-210的表達(dá)減少了細(xì)胞侵襲能力。
　　結(jié)論:
　　(1).MiRNA-210在MPNST細(xì)胞ST88-14和sNF96.2中表達(dá)升高。
　　(2).MiRNA-210促進(jìn)了MPNST細(xì)胞的增殖和侵襲能力。
　　第二部分.MiRNA-210在MPNST中靶向抑制了EFNA3基因的表達(dá)
　　目的:
　　(1)

9、.識(shí)別miRNA-210在MPNST細(xì)胞中調(diào)控的靶基因。
　　(2).研究miRNA-210在MPNST細(xì)胞中調(diào)控EFNA3基因的分子機(jī)制。
　　方法和結(jié)果:
　　(1).通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miRNA-210在MPNST細(xì)胞系ST88-14和sNF96.2細(xì)胞中對(duì)潛在的靶基因包括EFNA3、MNT、AIFM3、ZNF462、GIT2(PKL)的表達(dá)水平的影響，結(jié)果表明在ST88-14和sNF96.2細(xì)胞中EFNA3

10、表達(dá)顯著降低。
　　(2).生物信息學(xué)對(duì)EFNA3基因mRNA的3'非翻譯區(qū)進(jìn)行分析，識(shí)別了一個(gè)潛在的miRNA-210結(jié)合位點(diǎn)。
　　(3).分別將野生型以及突變了miRNA-210結(jié)合位點(diǎn)的EFNA3基因mRNA的3'非翻譯區(qū)序列克隆進(jìn)入報(bào)告基因載體psi-CHECK2，命名為EFNA3-3'UTR-psi-CHECK2和Mut-EFNA3-3'UTR-psi-CHECK2。通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，發(fā)現(xiàn)miRNA-21

11、0能夠顯著的抑制野生型報(bào)告基因載體EFNA3-3'UTR-psi-CHECK2的熒光素酶活性，而對(duì)突變型報(bào)告基因載體Mut-EFNA3-3'UTR-psi-CHECK2的熒光素酶活性沒(méi)有影響。
　　(4).通過(guò)RT-PCR和western blot分析anti-miRNA-210、pre-miRNA-210或相應(yīng)對(duì)照在MPNST細(xì)胞系ST88-14和sNF96.2細(xì)胞中EFNA3基因的表達(dá)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pre-miRNA-210

12、進(jìn)入ST88-14和sNF96.2細(xì)胞中能夠顯著增加miRNA-210和減少EFNA3mRNA水平。然而，轉(zhuǎn)染anti-miRNA-210進(jìn)入ST88-14和sNF96.2細(xì)胞中則減少miRNA-210和增加了EFNA3mRNA水平。
　　結(jié)論:
　　MiRNA-210能夠靶向調(diào)節(jié)EFNA3基因的表達(dá)，暗示了miRNA-210可能通過(guò)靶向抑制EFNA3基因的表達(dá)調(diào)節(jié)MPNST細(xì)胞的增殖和侵襲。
　　第三部分.MiRNA

13、-210介導(dǎo)的EFNA3基因的抑制在MPNST細(xì)胞增殖和侵襲中的作用
　　目的:
　　研究miRNA-210介導(dǎo)的EFNA3基因的抑制在MPNST細(xì)胞增殖和侵襲中的作用。
　　方法和結(jié)果:
　　(1).分別構(gòu)建EFNA3-Talen(L)和EFNA3-Talen(L)載體，并將兩個(gè)載體一起分別轉(zhuǎn)染進(jìn)入MPNST細(xì)胞系ST88-14和sNF96.2細(xì)胞中，分別構(gòu)建EFNA3敲除細(xì)胞系包括ST88-14-EFNA3-

14、Talen和sNF96.2-EFNA3-Talen。
　　(2).通過(guò)MTT分析miRNA-210過(guò)表達(dá)對(duì)EFNA3敲除細(xì)胞系包括ST88-14-EFNA3-Talen和sNF96.2-EFNA3-Talen穩(wěn)定細(xì)胞系以及對(duì)照細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miRNA-210進(jìn)入ST88-14-EFNA3-Talen和sNF96.2-EFNA3-Talen穩(wěn)定細(xì)胞系后的增殖速度并不快于miRNA-210轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞。
　

15、　(3).通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)分析miRNA-210過(guò)表達(dá)對(duì)空白細(xì)胞或EFNA3敲除細(xì)胞系包括ST88-14-EFNA3-Talen和sNF96.2-EFNA3-Talen穩(wěn)定細(xì)胞系侵襲能力的影響。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miRNA-210的EFNA3敲除細(xì)胞系的侵襲能力強(qiáng)于轉(zhuǎn)染miRNA-210的空白對(duì)照細(xì)胞系。
　　結(jié)論:
　　MiRNA-210誘導(dǎo)的EFNA3表達(dá)抑制只是部分促進(jìn)了MPNST細(xì)胞的增殖。MiRNA-210的