ARHGEF5基因在NSCLC增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景:
　　肺癌是目前全球發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤,80％以上為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)[1]。雖然針對NSCLC的臨床治療有了一些進(jìn)展,但還是以外科手術(shù)、化療和放療為主,目前,N S C L C的5年生存率僅僅10-15%。最近,針對NSCLC的腫瘤信號分子的研究,包括EGFR、Notch3和 W nt信號通路獲得了較大的進(jìn)展。但是,由于目前對肺癌發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制還并

2、不清楚,仍然缺乏敏感和特異的腫瘤分子標(biāo)記用以評價(jià)患者的預(yù)后,以及作為可能的分子靶點(diǎn)。所以,篩選、鑒定與肺癌相關(guān)的基因和蛋白,并深入研究其與肺癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性及分子機(jī)制,是肺癌研究領(lǐng)域的一個(gè)重要方向。
　　Src是一個(gè)特別有希望的抗癌分子靶點(diǎn),它通過p190RhoGAP和黏著斑激酶的磷酸化調(diào)控細(xì)胞骨架的重組,調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附和運(yùn)動(dòng),從而在肺癌侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用[2]。雖然src抑制劑Dasatinib已經(jīng)進(jìn)入了III期臨床實(shí)驗(yàn),

3、但是仍需配合EGFR等分子的抑制劑,才能達(dá)到預(yù)期的效果[3]。從而提示:src下游的關(guān)鍵信號蛋白及其信號傳導(dǎo)通路需要進(jìn)一步的研究探索。
　　ARHGEF5(Rho guanine nucleotide exchange factor5)是鳥嘌呤核苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factors family, GEFs)中 Dbl家族成員之一[4]。其基因定位于人類染色體的7q33-q35[5]

4、,編碼的的蛋白有重鏈和輕鏈兩種亞型,由一條mRNA編碼,均由D H區(qū)、P H區(qū)、SH3域以及C端的脯氨酸構(gòu)成。輕鏈含有519個(gè)氨基酸,分子量為60KDa重鏈含有1597個(gè)氨基酸,分子量約為170?200KDa。短鏈亞型最初是從人乳腺癌細(xì)胞株中鑒定分離出來,命名為TIM(Transforming Immortalized Mammary)[1]。有人發(fā)現(xiàn)TIM的突變剪接體在乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中扮演了重要的角色[2]。最近有篇文獻(xiàn)報(bào)道了 ARH

5、GEF5重鏈亞型作用特點(diǎn),即ARHGEF5重鏈亞型可以被src激活,并在偽足形成中發(fā)揮了重要作用,過表達(dá)的ARHGEF5重鏈亞型通過活化RhoA,促進(jìn)了肌動(dòng)蛋白張力絲重塑。而src誘導(dǎo)偽足小體結(jié)構(gòu)RhoA或Cdc42的活化[3]。既往的研究僅著眼于細(xì)胞骨架改變、偽足的形成等表觀現(xiàn)象,而對該信號通路可能的下游信號傳導(dǎo),以及導(dǎo)致腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制,尚無相關(guān)報(bào)道。
　　增殖、粘附、侵襲和轉(zhuǎn)移是原癌基因的致瘤特點(diǎn)。盡管ARHGEF5基因鑒

6、定為原癌基因,但是在相關(guān)腫瘤中的研究較少。這是因?yàn)锳RHGEF5所在的D b l家族有70多個(gè)成員,絕大多數(shù)功能不明。但是D b l家族蛋白所屬的GEFs家族,目前已經(jīng)越來越受到重視,并成為癌癥靶向治療的熱點(diǎn)。ARHGEF5是從乳腺癌細(xì)胞中分離,它的突變剪接體在乳腺癌細(xì)胞中發(fā)揮了重要作用,但在人NSCLC中的表達(dá)、作用及機(jī)制目前國內(nèi)未見報(bào)道,國外少有文獻(xiàn)報(bào)道。因此,本研究結(jié)合臨床資料,應(yīng)用基因沉默及體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)等研究方法,從人群、體外N

7、S C L C細(xì)胞和裸鼠體內(nèi)水平探討ARHGEF5基因在NSCLC發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制,有望為NSCLC的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)和新的理論依據(jù)。
　　研究目的:
　　揭示ARHGEF5基因?qū)SCLC增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的致瘤作用,并探討ARHGEF5在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中的作用及其可能的機(jī)制,為深入理解ARHGEF5在NSCLC中的作用進(jìn)行初步探索,以期為NSCLC新的診斷和治療方法提供研究基礎(chǔ)。
　　研究方法:<

8、br>　　1. ARHGEF5在NSCLC中的表達(dá)及其作用
　　應(yīng)用免疫組化檢測193例NSCLC癌組織及其對應(yīng)的遠(yuǎn)癌組織中ARHGEF5和 src蛋白的表達(dá)、Western Blot檢測了4例肺鱗癌和肺腺癌組織、5種NSCLC細(xì)胞株和HBE中 ARHGEF5蛋白的表達(dá),同時(shí)運(yùn)用免疫熒光檢測人N S C L C組織中ARHGEF5和 src的共表達(dá)。
　　2. ARHGEF5基因沉默對NSCLC細(xì)胞株增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等特性的影

9、響,以及相關(guān)信號通路的初步探討
　　根據(jù)ARHGEF5基因在人N S C L C細(xì)胞株中的表達(dá)情況,選擇 ARHGEF5中度表達(dá)、具有一定成瘤及轉(zhuǎn)移能力的A549和NCI-H1650細(xì)胞株,將ARHGEF5 siRNA轉(zhuǎn)染A549和NCI-H1650細(xì)胞株,24hr后采用RT-PCR及Western blot方法鑒定轉(zhuǎn)染后ARHGEF5基因在細(xì)胞中的表達(dá)情況并進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的功能驗(yàn)證,包括細(xì)胞的增殖、凋亡、細(xì)胞周期的改變,以及粘附、

10、侵襲和遷移。
　　運(yùn)用免疫熒光雙標(biāo)記法、免疫共沉淀技術(shù),驗(yàn)證人N S C L C細(xì)胞中src和 ARHGEF5的共定位表達(dá),以及物理性的結(jié)合。Western Blot、PCR法檢測下游效應(yīng)蛋白的表達(dá)。利用文獻(xiàn)及上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,推測ARHGEF5下調(diào)后可能的靶蛋白,并從中選取與增殖、侵襲轉(zhuǎn)移特性密切相關(guān)的CyclinD1和M M Ps蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。
　　3. ARHGEF5在裸鼠體內(nèi)作用的初步探討
　　根據(jù)ARHGEF5(

11、NM—005435.3)靶基因序列,構(gòu)建RNA干擾慢病毒載體。用含ARHGEF5干擾序列的慢病毒感染A549細(xì)胞,同時(shí)設(shè)置慢病毒陰性對照組和空白對照組。建立慢病毒載體轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞的裸鼠皮下移植瘤模型。通過建立動(dòng)物模型,體內(nèi)研究ARHGEF5對NSCLC細(xì)胞的影響。
　　結(jié)果:
　　1. NSCLC組織和細(xì)胞株中ARHGEF5的表達(dá)。
　　免疫組化結(jié)果表明:ARHGEF5在大多數(shù)肺癌組織中呈現(xiàn)出陽性表達(dá):陽性率為6

12、8.91%(69/193)。其中腺癌68.09%(64/94),鱗癌69.70%(69/99),而在對應(yīng)的遠(yuǎn)癌組織中幾乎全部為陰性表達(dá)。Western Blot結(jié)果也發(fā)現(xiàn)ARHGEF5在正常人支氣管上皮細(xì)胞 HBE中低表達(dá),在5種 NSCLC細(xì)胞株中高表達(dá)。ARHGEF5陽性染色與年齡、分化、腫瘤分期具有顯著性差異(p<0.05)而與病理類型、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ARHGEF5與 src在腺癌組織中的共表達(dá)率明顯高于鱗癌,相關(guān)

13、性有顯著差異(p<0.05)
　　2. ARHGEF5基因沉默對NSCLC細(xì)胞增殖、粘附、侵襲遷移的影響,以及可能的信號通路
　　成功將ARHGEF5 siRAN瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人NSCLC細(xì)胞株(A549和NCI-H1650),明顯下調(diào)了 ARHGEF5蛋白的表達(dá)將含ARHGEF5 siRNA轉(zhuǎn)染A549和NCI-H1650細(xì)胞,可以降低肺癌細(xì)胞的增殖、粘附、侵襲和遷移,但是對細(xì)胞凋亡無明顯影響。初步探討了可能激活的靶蛋白及其相關(guān)

14、的信號通路,發(fā)現(xiàn)下調(diào)ARHGEF5基因在A549和NCI-H1650細(xì)胞中的表達(dá)后,均可以在蛋白水平顯著降低p-src、p-Akt、NF-kB、CyclinD1和MMP2的表達(dá)PCR檢測CyclinD1和MMP2 mRNA也明顯降低。
　　3.沉默ARHGEF5基因抑制了 A549細(xì)胞皮下移植瘤的生長
　　成功構(gòu)建了 ARHGEF5基因下調(diào)表達(dá)的慢病毒載體,建立了穩(wěn)定下調(diào)ARHGEF5基因的A549細(xì)胞株。隨后將感染了慢病毒

15、的A549細(xì)胞皮下注射裸鼠,建立皮下移植瘤模型。在裸鼠模型上,干擾ARHGEF5的慢病毒在穩(wěn)定篩選的細(xì)胞中有效的下調(diào)了ARHGEF5蛋白的表達(dá),并能有效的抑制人肺癌裸鼠皮下移植瘤的生長。
　　結(jié)論:
　　1.在 NSCLC手術(shù)切除患者中,ARHGEF5的表達(dá),與患者的年齡、腫瘤分期和分化密切相關(guān)(p<0.05)。并且肺腺癌中,ARHGEF5與 src共表達(dá)的相關(guān)性顯著高于肺鱗癌(p<0.05)。
　　2.原癌基因ARH