MicroRNAs調(diào)控胸部腫瘤中PLK1、BMI1和DAB2基因的分子機制及生物學(xué)功能的研究.pdf

1、目的：
　　肺癌和食管癌目前成為胸部腫瘤研究的熱點，在我國的發(fā)病率一直居高不下，尤其是近年來肺癌的發(fā)病率增長速度急劇增加，其中非小細胞肺癌（NSCLC）占85％以上。食管癌是原發(fā)于食管的惡性腫瘤，主要以食管鱗癌（ESCC）為主。肺癌與食管癌早期癥狀不明顯，絕大多數(shù)患者就診時已是中晚期，所以缺乏早期的診斷標(biāo)記物是目前肺癌和食管癌高死亡率的主要原因。
　　Polo樣激酶1（Polo-like kinase1，PLK1）是一種細胞

2、周期調(diào)節(jié)分子，在有絲分裂過程中起重要作用。BMI1作為多梳基因家族的一種關(guān)鍵癌基因，參與細胞的自我更新和增殖，對調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和促進腫瘤轉(zhuǎn)移具有重要作用。DAB2蛋白是一種廣泛表達的細胞內(nèi)吞適配器，在多種細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮主要作用，DAB2在多種癌癥中表達下降或缺失，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。
　　MicroRNAs（miRNAs）是一類短鏈非編碼RNAs，通過對基因轉(zhuǎn)錄后抑制調(diào)節(jié)基因的表達。許多研究表明mi

3、RNAs在非小細胞肺癌（NSCLC）和食管鱗癌（ESCC）中表達異常并在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。本課題旨在探討胸部腫瘤中PLK1、BMI1和DAB2異常表達的miRNAs調(diào)控機制，為胸部腫瘤的早期診斷和治療提供確鑿的實驗依據(jù)。
　　方法：
　　一．在非小細胞肺癌中miR-296-5p通過靶向調(diào)控PLK1抑制細胞增殖
　　1.運用生物信息學(xué)方法預(yù)測及驗證具有靶向調(diào)控PLK1的mircoRNAs
　　通過生物信

4、息學(xué)軟件 TargetScan、PicTar和 mirBase對直接調(diào)控 PLK1的mircoRNAs進行預(yù)測。查找 miR-296-5p的成熟體序列并合成 miR-296-5p的模擬體mimics瞬時轉(zhuǎn)染A549細胞，利用Western blot檢測轉(zhuǎn)染前后PLK1蛋白表達變化。預(yù)先將miR-296-5p mimics和含PLK1-3’UTR的雙熒光素酶報告載體共轉(zhuǎn)染NSCLC細胞，運用雙熒光素酶活性實驗檢測miR-296-5p是否與

5、PLK13’UTR區(qū)域的種子序列直接結(jié)合。
　　2. miR-296-5p通過靶向調(diào)控PLK1影響NSCLC細胞的生物學(xué)功能
　　用實時熒光定量 PCR（qPCR）的方法檢測臨床病人 NSCLC組織和癌旁組織中PLK1 mRNA和miR-296-5p的相對表達量。選取人正常支氣管上皮細胞HBE和5株肺癌細胞（A549、95C、95D、LTEP-α-2和H1299）用Western blot的方法檢測PLK1的蛋白表達水平，同

6、時用 qPCR方法檢測 miR-296-5p的相對表達量。用 miR-296-5p mimics和PLK1-siRNA分別轉(zhuǎn)染NSCLC細胞，通過CCK-8和EdU方法檢測上述基因?qū)SCLC細胞增殖的影響；
　　二．在非小細胞肺癌中miR-203通過靶向調(diào)控BMI1抑制細胞增殖和侵襲
　　1.運用生物信息學(xué)方法預(yù)測及驗證具有靶向調(diào)控BMI1的mircoRNAs
　　通過生物信息學(xué)軟件 TargetScan、PicTa

7、r和 mirBase對直接調(diào)控 BMI1的mircoRNAs進行預(yù)測。查找miR-203的成熟體序列并合成miR-203的模擬體mimics瞬時轉(zhuǎn)染LTEP-α-2細胞，利用Western blot檢測轉(zhuǎn)染前后BMI1蛋白表達變化。運用雙熒光素酶活性實驗檢測miR-203是否與BMI13’UTR區(qū)域的種子序列直接結(jié)合。
　　2. miR-203通過靶向調(diào)控BMI1影響NSCLC細胞的生物學(xué)功能
　　用實時熒光定量PCR（qP

8、CR）的方法檢測臨床病人NSCLC組織和癌旁組織中BMI1mRNA和miR-203的相對表達量。選取人正常支氣管上皮細胞HBE和6株肺癌細胞（A549、H1650、H226、H1299、H460和LTEP-α-2）用Western blot的方法檢測BMI1的蛋白表達水平。用 miR-203 mimics和 BMI1-siRNA分別轉(zhuǎn)染 NSCLC細胞，通過CCK-8和EdU方法檢測上述基因?qū)SCLC細胞增殖的影響。用Transwel

9、l試驗檢測miR-203和BMI1對NSCLC細胞侵襲能力的影響，流式細胞儀檢測miR-203和BMI1對NSCLC細胞凋亡的作用。
　　三．在食管鱗癌中miR-93通過靶向調(diào)控DAB2促進細胞增殖和侵襲
　　1.運用生物信息學(xué)方法預(yù)測及驗證具有靶向調(diào)控DAB2的mircoRNAs
　　通過生物信息學(xué)軟件TargetScan對直接調(diào)控DAB2的mircoRNAs進行預(yù)測。查找miR-93的成熟體序列并合成miR-93的

10、模擬體mimics瞬時轉(zhuǎn)染EC109細胞，利用Western blot檢測轉(zhuǎn)染前后 DAB2蛋白表達變化。運用雙熒光素酶活性實驗檢測miR-93是否與DAB2-3’UTR區(qū)域的種子序列直接結(jié)合。
　　2.miR-93通過靶向調(diào)控DAB2影響ESCC細胞的生物學(xué)功能
　　用實時熒光定量 PCR（qPCR）的方法檢測臨床病人 NSCLC組織和癌旁組織中DAB2 mRNA和miR-93的相對表達量。用miR-93 mimics和D

11、AB2-siRNA分別轉(zhuǎn)染ESCC細胞，通過CCK-8和EdU方法檢測上述基因?qū)SCC細胞增殖的影響。流式細胞儀檢測miR-93和DAB2對ESCC細胞周期的影響。用Transwell試驗檢測miR-93和DAB2對ESCC細胞侵襲能力的影響。
　　四．在食管鱗癌中miR-218通過靶向調(diào)控BMI1抑制細胞增殖和遷移
　　1.運用生物信息學(xué)方法預(yù)測及驗證具有靶向調(diào)控BMI1的mircoRNAs
　　通過生物信息學(xué)軟件

12、 TargetScan、PicTar和 mirBase對直接調(diào)控 BMI1的mircoRNAs進行預(yù)測。查找miR-218的成熟體序列并合成miR-218的模擬體mimics瞬時轉(zhuǎn)染EC109細胞，利用Western blot檢測轉(zhuǎn)染前后BMI1蛋白表達變化。運用雙熒光素酶活性實驗檢測miR-218是否與BMI13’UTR區(qū)域的種子序列直接結(jié)合。
　　2. miR-218通過靶向調(diào)控BMI1影響ESCC細胞的生物學(xué)功能
　　

13、用實時熒光定量 PCR（qPCR）的方法檢測臨床病人 ESCC組織和癌旁組織中miR-218和BMI1mRNA的相對表達量。用正常食管上皮細胞（HEEC）作為對照，通過qPCR試驗檢測miR-218和BMI1 mRNA在ESCC細胞中的表達情況。用miR-218 mimics和BMI1-siRNA分別轉(zhuǎn)染ESCC細胞，通過CCK-8和EdU方法檢測上述基因?qū)SCC細胞增殖的影響。用Transwell試驗檢測miR-218和BMI1對E

14、SCC細胞遷移和侵襲能力的影響。流式細胞儀檢測miR-218和BMI1對ESCC細胞凋亡的作用。合成過表達BMI1（不含3’UTR）質(zhì)粒，構(gòu)建過表達BMI1的ESCC細胞株，轉(zhuǎn)染miR-218 mimics后，檢測BMI1蛋白表達量的變化及對細胞表型的影響。
　　結(jié)果：
　　一．在非小細胞肺癌中miR-296-5p通過靶向調(diào)控PLK1抑制細胞增殖
　　1．miR-296-5p靶向結(jié)合PLK1-3’UTR區(qū)域調(diào)控PLK1

15、的蛋白表達。
　　用miR-296-5p mimics轉(zhuǎn)染NSCLC細胞，Western blot顯示PLK1蛋白表達量較對照組明顯下降。運用生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-296-5p與PLK1-3’UTR的結(jié)合位點。用雙熒光素酶活性實驗檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-296-5p與PLK1-3’UTR區(qū)域的種子序列直接結(jié)合。
　　2. miR-296-5p通過靶向調(diào)控PLK1影響NSCLC細胞的生物學(xué)功能
　　在NSCLC組織中，P

16、LK1的mRNA表達水平較癌旁組織明顯升高（P<0.01），而miR-296-5p的表達水平較癌旁組織明顯下降（P<0.01）。與HBE細胞株相比PLK1的蛋白表達量在NSCLC細胞株中明顯上升，而miR-296-5p的表達量在NSCLC細胞株中均下降。用miR-296-5p mimics和PLK1-siRNA瞬時轉(zhuǎn)染NSCLC細胞株，通過CCK-8和EdU方法檢測細胞增殖，結(jié)果顯示過表達miR-296-5p和下調(diào)PLK1表達均能抑制N

17、SCLC細胞的增殖。
　　二．在非小細胞肺癌中miR-203通過靶向調(diào)控BMI1抑制細胞增殖和侵襲
　　1．miR-203靶向結(jié)合BMI1-3’UTR區(qū)域調(diào)控BMI1的蛋白表達。
　　用miR-203 mimics轉(zhuǎn)染NSCLC細胞，Western blot顯示BMI1蛋白表達量較對照組明顯下降。運用生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-203與BMI1-3’UTR的結(jié)合位點。用雙熒光素酶活性實驗檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-203與BMI

18、1-3’UTR區(qū)域的種子序列直接結(jié)合。
　　2. miR-203通過靶向調(diào)控BMI1影響NSCLC細胞的生物學(xué)功能
　　在NSCLC組織中 BMI1mRNA表達水平較癌旁組織明顯上升（P<0.01），而miR-203的表達水平較癌旁組織明顯下降（P<0.01）。與HBE細胞株相比BMI1的蛋白表達量在NSCLC細胞株中明顯上升。用miR-203 mimics和BMI1-siRNA瞬時轉(zhuǎn)染NSCLC細胞株，CCK-8和EdU方

19、法檢測細胞增殖，結(jié)果顯示過表達miR-203和下調(diào)BMI1表達均能抑制NSCLC細胞增殖。用miR-203 mimics和BMI1-siRNA瞬時轉(zhuǎn)染NSCLC細胞株，流式細胞儀檢測顯示過表達miR-203或下調(diào)BMI1的表達均能促進細胞凋亡。用miR-203 mimics和BMI1-siRNA瞬時轉(zhuǎn)染NSCLC細胞株，侵襲實驗表明過表達miR-203或下調(diào)BMI1表達均能抑制細胞侵襲能力。
　　三．在食管鱗癌中miR-93通過靶

20、向調(diào)控DAB2促進細胞增殖和侵襲
　　1. miR-93靶向結(jié)合DAB2-3’UTR區(qū)域調(diào)控DAB2的蛋白表達。
　　用miR-93 mimics轉(zhuǎn)染ESCC細胞，Western blot顯示DAB2蛋白表達量較對照組明顯下降。運用生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-93與DAB2-3’UTR的結(jié)合位點。用雙熒光素酶活性實驗檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-93與DAB2-3’UTR區(qū)域的種子序列直接結(jié)合。
　　2. miR-93通過靶向調(diào)控

21、DAB2影響ESCC細胞的生物學(xué)功能
　　在ESCC組織中 DAB2 mRNA表達水平較癌旁組織明顯下降（P<0.01），而miR-93的表達水平較癌旁組織明顯上升（P<0.05）。用miR-93 mimics和DAB2-siRNA瞬時轉(zhuǎn)染ESCC細胞株，CCK-8和EdU方法檢測細胞增殖，結(jié)果顯示過表達miR-93和下調(diào)DAB2表達均能促進ESCC細胞的增殖。用miR-93 mimics和DAB2-siRNA瞬時轉(zhuǎn)染ESCC細胞

22、株，流式細胞儀檢測顯示過表達miR-93或下調(diào)DAB2的表達均能促進細胞周期。用miR-93 mimics和DAB2-siRNA瞬時轉(zhuǎn)染ESCC細胞株，侵襲實驗表明過表達miR-93或下調(diào)DAB2表達均能促進細胞侵襲能力。
　　四．在食管鱗癌中miR-218通過靶向調(diào)控BMI1抑制細胞增殖和遷移
　　1．miR-218靶向結(jié)合BMI1-3’UTR區(qū)域調(diào)控BMI1的蛋白表達
　　用miR-218 mimics轉(zhuǎn)染ESCC

23、細胞，Western blot顯示BMI1蛋白表達量較對照組明顯下降。運用生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-218與BMI1-3’UTR的結(jié)合位點。用雙熒光素酶活性實驗檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-218與BMI1-3’UTR區(qū)域的種子序列直接結(jié)合。
　　2. miR-218通過靶向調(diào)控BMI1影響ESCC細胞的生物學(xué)功能
　　在ESCC組織中 miR-218表達水平較癌旁組織明顯下降（P<0.01），而BMI1 mRNA的表達水平較癌旁組織

24、明顯上升（P<0.01）。與HEEC細胞株相比miR-218表達量在ESCC細胞株中明顯下降。用miR-218mimics和BMI1-siRNA瞬時轉(zhuǎn)染ESCC細胞株，CCK-8和EdU方法檢測結(jié)果顯示過表達miR-218和下調(diào)BMI1表達均能抑制ESCC細胞的增殖；流式細胞儀檢測顯示過表達miR-218或下調(diào)BMI1的表達均能促進細胞凋亡；侵襲實驗表明過表達miR-218或下調(diào)BMI1的表達均能抑制細胞的侵襲能力。用miR-218 m

25、imics轉(zhuǎn)染過表達PLK1但不含3’UTR質(zhì)粒的ESCC細胞株，Western blot顯示miR-218下調(diào)BMI1的蛋白表達，但這種下調(diào)結(jié)果可被轉(zhuǎn)染PLK1質(zhì)粒恢復(fù)。同時miR-218誘導(dǎo)的抑制ESCC的細胞增殖、細胞劃痕和細胞侵襲的效果可被過表達PLK1的質(zhì)?；謴?fù)。
　　結(jié)論：
　　1. miR-296-5p通過靶向結(jié)合PLK1抑制NSCLC細胞的增殖。
　　2. miR-203通過靶向結(jié)合BMI1抑制NSCL