多囊腎病中Cordon-bleu影響初級纖毛結(jié)構(gòu)和功能的上下游機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:
　　常染色體顯性多囊腎病是最常見的單基因遺傳性腎病，由PKD1或PKD2基因突變引起編碼的PC1和PC2表達(dá)異常所致，二種蛋白均表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞的初級纖毛。初級纖毛致病假說是目前最為關(guān)注的多囊腎病共同發(fā)病通路。前期課題組成功建立了多囊腎病PKD1基因敲入小鼠模型，通過蛋白組學(xué)的研究獲得了多個(gè)囊腫相關(guān)差異表達(dá)蛋白，其中蛋白cordon bleu(Cobl)經(jīng)過前期研究，發(fā)現(xiàn)在多囊腎病腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)異常，并引起初

2、級纖毛的結(jié)構(gòu)和功能變化。但Cobl如何被調(diào)控？Cobl又是通過哪個(gè)途徑來影響初級纖毛，其機(jī)制尚未明確。本課題擬通過Western-blot、Realtime PCR、免疫熒光等實(shí)驗(yàn)方法，明確PC1/PC2的異常是否通過Ca2+/CaM來調(diào)控Cobl表達(dá);Cobl是否在SNX9作用下引起細(xì)胞骨架紊亂而導(dǎo)致初級纖毛異常。本課題的研究結(jié)果將豐富多囊腎病中初級纖毛的發(fā)病機(jī)制，為尋找干預(yù)靶標(biāo)奠定一定的理論基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1

3、.CaM調(diào)控Cobl的機(jī)制研究:
　　(1)通過免疫熒光、免疫組化方法觀察多囊腎細(xì)胞及小鼠腎臟組織中CaM的定位變化情況。
　　(2)應(yīng)用Real-time PCR及Western blot方法檢測正常人腎小管上皮細(xì)胞(RCTEC)與不表達(dá)PC1的人多囊腎囊腫襯里上皮細(xì)胞(WT9-12)，以及正常對照小鼠(pkd1+/+)與多囊腎病動(dòng)物模型pkd1條件敲除小鼠(pkd1-/-)腎臟組織中CaM的表達(dá)。
　　(3)應(yīng)用W

4、estern blot方法檢測RCTEC中經(jīng)siRNA干擾PC2表達(dá)對PC2、CaM以及KIF3A的表達(dá)影響。
　　(4)利用免疫共沉淀及免疫熒光方法檢測CaM與Cobl之間存在的相互結(jié)合作用，以及應(yīng)用免疫熒光的方法驗(yàn)證RCTEC中CaM與Cobl之間的定位。
　　(5)應(yīng)用Western blot方法檢測經(jīng)W7抑制RCTEC中CaM表達(dá)后對CaM、Cobl、KIF3A、IFT88的表達(dá)變化。
　　(6)利用激光共聚焦

5、顯微鏡觀察W7抑制CaM的RCTEC中初級纖毛形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。
　　(7)應(yīng)用Western blot檢測經(jīng)CaCl2刺激RCTEC后CaM、Cobl、KIF3A的表達(dá)變化。
　　(8)利用激光共聚焦顯微鏡觀察經(jīng)CaCl2刺激RCTEC后初級纖毛形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。
　　2.SNX9在Cobl影響初級纖毛結(jié)構(gòu)和功能的作用研究:
　　(1)通過免疫熒光、免疫組化方法觀察多囊腎細(xì)胞及小鼠腎臟組織中SNX9的定位變化。

6、　　(2)應(yīng)用Real-time PCR及Western blot方法檢測正常人腎小管上皮細(xì)胞(RCTEC)與人多囊腎囊腫襯里上皮細(xì)胞(WT9-12)，以及正常對照小鼠(pkd1+/+)與多囊腎病動(dòng)物模型pkd1條件敲除小鼠（pkd1-/-）腎臟組織中SNX9的表達(dá)。
　　(3)應(yīng)用Western blot方法檢測RCTEC中轉(zhuǎn)染Cobl質(zhì)粒過表達(dá)和經(jīng)siRNA干擾Cobl后對Cobl、SNX9、KIF3A和IFT88的表達(dá)變化。

7、
　　(4)應(yīng)用Real-time PCR檢測SNX9基因過表達(dá)慢病毒的滴度，應(yīng)用Real-time PCR及Western blot方法進(jìn)行病毒液目的基因表達(dá)檢測。
　　(5)通過Western blot方法檢測RCTEC中SNX9基因慢病毒過表達(dá)對SNX9以及纖毛功能指標(biāo)KIF3A和IFT88的表達(dá)變化。
　　(6)應(yīng)用Western blot檢測RCTEC中經(jīng)siRNA-SNX9干擾下調(diào)后SNX9和IFT88的表

8、達(dá)。
　　(7)利用激光共聚焦顯微鏡觀察SNX9基因慢病毒過表達(dá)SNX9及siRNA感染下調(diào)SNX9的RCTEC中F-actin、初級纖毛形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。
　　結(jié)果:
　　1.CaM調(diào)控Cobl的機(jī)制研究:
　　(1)通過免疫熒光方法觀察發(fā)現(xiàn)CaM主要定位于胞漿與核膜;免疫組化方法觀察發(fā)現(xiàn)pkd1+/+與pkd1-/-腎臟組織中CaM主要位于腎小管中。
　　(2)應(yīng)用Real-time PCR及Wester

9、n blot方法檢測發(fā)現(xiàn)RCTEC中CaM表達(dá)較WT9-12明顯增多;pkd1條件敲除小鼠（pkd1-/-）腎臟組織中也得到相同結(jié)果。
　　(3)應(yīng)用Western blot方法檢測發(fā)現(xiàn)RCTEC經(jīng)siRNA干擾下調(diào)PC2表達(dá)后中PC2、CaM、KIF3A表達(dá)均減少。
　　(4)應(yīng)用免疫共沉淀方法檢測發(fā)現(xiàn)CaM與Cobl存在相互作用;同時(shí)，通過免疫熒光方法發(fā)現(xiàn)RCTEC中CaM與Cobl之間存在共定位。
　　(5)應(yīng)用

10、Western blot及Real-time PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)經(jīng)W7抑制RCTEC中CaM表達(dá)后，CaM、Cobl、KIF3A和IFT88的表達(dá)均下降。
　　(6)利用激光共聚焦顯微鏡觀察RCTEC中W7抑制CaM后初級纖毛長度變短。
　　(7)應(yīng)用Western blot及Real-time PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)經(jīng)CaCl2刺激RCTEC后CaM、Cobl、KIF3A的表達(dá)均增加。
　　(8)利用激光共聚焦顯微鏡觀察

11、經(jīng)CaCl2刺激RCTEC后初級纖毛長度變長。
　　2.SNX9在Cobl影響初級纖毛結(jié)構(gòu)和功能的作用研究:
　　(1)應(yīng)用免疫熒光、免疫組化方法觀察發(fā)現(xiàn)SNX9位于胞漿和細(xì)胞核，且主要位于腎小管。
　　(2)應(yīng)用Real-time PCR及Western blot方法檢測發(fā)現(xiàn)RCTEC中SNX9表達(dá)較WT9-12中明顯增多;多囊腎病動(dòng)物模型pkd1條件敲除小鼠腎臟組織中也有相同的結(jié)果。
　　(3)應(yīng)用Weste

12、rn blot方法檢測發(fā)現(xiàn)RCTEC中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達(dá)Cobl后，Cobl、SNX9、纖毛功能指標(biāo)(KIF3A、IFT88)的表達(dá)均增加。
　　(4)應(yīng)用Western blot方法檢測發(fā)現(xiàn)RCTEC中經(jīng)siRNA-Cobl轉(zhuǎn)染干擾Cobl表達(dá)后，Cobl、SNX9、KIF3A、IFT88的表達(dá)均減少。
　　(5) SNX9基因過表達(dá)慢病毒大量包裝及應(yīng)用Real-time PCR進(jìn)行滴度測定，包裝所得慢病毒滴度至少為108 T

13、U/ml;應(yīng)用Real-time PCR及Western blot方法進(jìn)行病毒液目的基因表達(dá)檢測，發(fā)現(xiàn)SNX9過表達(dá)慢病毒有過表達(dá)效果，且在MOI-5時(shí)感染率已達(dá)到飽和。
　　(6)應(yīng)用Western blot方法檢測發(fā)現(xiàn)RCTEC中SNX9基因慢病毒過表達(dá)SNX9后，SNX9、KIF3A和IFT88的表達(dá)均增加。
　　(7)應(yīng)用Western blot方法檢測發(fā)現(xiàn)RCTEC中SNX9-siRNA下調(diào)SNX9表達(dá)后，SNX9

14、、KIF3A、IFT88的表達(dá)均減少。
　　(8)利用激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)RCTEC中SNX9基因慢病毒過表達(dá)SNX9，F(xiàn)-actin聚合增加，纖毛長度增加;而siRNA感染下調(diào)SNX9的RCTEC中F-actin含量減少，初級纖毛長度變短。
　　結(jié)論:
　　根據(jù)本研究的結(jié)果，表明當(dāng)多囊腎基因PKD1、PKD2突變引起PC1、PC2表達(dá)異常后，Ca2+內(nèi)流減少，CaM表達(dá)降低，Cobl表達(dá)也隨之減少。而Cobl異常