兩種多糖XG和Mp-A作用于細(xì)胞表面受體Toll-like receptor 4(TLR4)的免疫藥理學(xué)效應(yīng)及胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)分子機(jī)制研究.pdf

1、研究目的：
　　多糖是一類重要大分子物質(zhì)，具有多方面的藥理學(xué)活性，其作用主要包括:免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤、降血脂、抗病毒、降血壓、降血糖、增強(qiáng)骨髓造血機(jī)能等等。多糖的這些良好的藥理活性，以及幾乎無毒性的優(yōu)點(diǎn)，愈來愈引起國內(nèi)外生物化學(xué)家、藥理學(xué)家的興趣。
　　研究發(fā)現(xiàn)從香菇（Lentinus edodes）分離的β-葡聚糖LNT-S、從釀酒酵母（S.cerevisiae）分離的β-葡聚糖BBG均能抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子NO

2、，TNF-α，IL-1等的表達(dá)。這種抑制作用是通過抑制絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路的ERK1/2和JNK1/2的磷酸化而實(shí)現(xiàn)的。除了這兩種β-葡聚糖外，是否還有其它具有α或者β-葡聚糖結(jié)構(gòu)的多糖具有類似的生物學(xué)功能？是否所有D-葡聚糖結(jié)構(gòu)的多糖均具有這種生物學(xué)活性？換言之，這種構(gòu)效關(guān)系是否具有通用性？解決這些問題需要選擇更多的含葡聚糖結(jié)構(gòu)的多糖去驗(yàn)證和研究。

3、　　本課題是在實(shí)驗(yàn)室前期工作的基礎(chǔ)上開展，主要對(duì)2種以D-葡聚糖為主鏈的多糖的免疫調(diào)節(jié)作用及相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行研究。一種是來源于甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌(Xanthomonas camperstris)細(xì)菌胞外雜多糖黃原膠(xanthan gum，XG)，另一種是來源于貽貝（Mytilus coruscus）的均多糖(Mussel polysaccharide，MP-A)，兩者都屬于以D-葡聚糖為主鏈的高分子多糖。前期研究結(jié)果表明XG治療骨關(guān)節(jié)

4、炎動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究取得很好的效果，MP-A調(diào)血脂、抗炎功能的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究療效較好，兩者均無顯著毒副作用，良好安全性和有效性預(yù)示著優(yōu)良的成藥性和開發(fā)前景。
　　多糖的生物學(xué)活性與多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)、高級(jí)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)密切相關(guān)。XG和MP-A雖然來源不同，但與LNT-S和BBG相似的是它們的主鏈中也含有D-葡聚糖結(jié)構(gòu)，XG是含β-D-葡聚糖主鏈結(jié)構(gòu)的雜多糖，而MP-A是含α-D-葡聚糖結(jié)構(gòu)的同多糖。它們是否與已報(bào)道的LNT-S和BBG具有相似

5、的生物學(xué)活性和分子機(jī)制尚未可知，目前對(duì)于這兩種多糖的免疫藥效學(xué)活性尚缺乏相關(guān)的研究數(shù)據(jù)。
　　因此，本文對(duì)這2種多糖的免疫藥理學(xué)活性進(jìn)行考察，試圖確定其細(xì)胞外靶標(biāo)受體和胞內(nèi)的分子傳導(dǎo)機(jī)制。主要通過研究XG對(duì)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞的影響，考察其體外免疫調(diào)節(jié)活性，特別考察XG對(duì)脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)活化的巨噬細(xì)胞的作用，確證其可能結(jié)合的受體，進(jìn)一步通過多種技術(shù)手段胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。通過研究MP

6、-A對(duì)人THP-1巨噬細(xì)胞的影響，考察MP-A體外免疫調(diào)節(jié)作用，特別是MP-A對(duì)LPS誘導(dǎo)活化的THP-1細(xì)胞的作用，尋找和確證MP-A細(xì)胞表面受體，進(jìn)而初步研究其胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。
　　最后比較總結(jié)兩種D-葡聚糖結(jié)構(gòu)多糖XG和MP-A的免疫調(diào)節(jié)活性的特點(diǎn)及作用機(jī)制的異同，為活性多糖的構(gòu)效關(guān)系研究提供更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　研究方法：
　　1.XG體外免疫藥理學(xué)效應(yīng)研究
　　首先以小鼠RAW264.7細(xì)胞作為體外

7、實(shí)驗(yàn)體系，以LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞作為炎癥模型，采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒檢測測XG對(duì)其增殖或者毒性作用。主要試驗(yàn)方法包括:掃描電鏡(scanning electron microscopy，SEM)觀察XG對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞形態(tài)的影響;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞吞噬FITC-dextran實(shí)驗(yàn)來分析其對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響;Griess試劑法測定RAW264.7細(xì)胞經(jīng)XG作用后產(chǎn)生NO的

8、水平變化;ELISA試劑盒測定XG對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6及TNF-α細(xì)胞因子的影響;熒光定量RT-PCR分析XG對(duì)RAW264.7細(xì)胞iNOS、COX-2、IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA水平變化的影響;此外采用Western blot實(shí)驗(yàn)考察了XG對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞iNOS、COX-2蛋白表達(dá)量的影響，并運(yùn)用SPR技術(shù)分析XG與重組TLR4的結(jié)合情況。
　　2.XG作用于TLR4

9、胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究
　　采用小鼠RAW264.7細(xì)胞系，研究XG對(duì)LPS活化的巨噬細(xì)胞胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)分子機(jī)制，包括:用透射電鏡(transmission Electron Microscope，TEM)觀察XG對(duì)RAW264.7胞內(nèi)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響;用Griess試劑法測定用抗小鼠TLR4抗體共孵育RAW264.7細(xì)胞30分鐘后經(jīng)XG作用后產(chǎn)生NO的水平變化;機(jī)制研究采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測XG對(duì)RAW264.7細(xì)胞

10、中絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)以及免疫熒光檢測核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor-κ-gene binding，NF-κB）的核轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，并運(yùn)用SPR技術(shù)分析XG除了TLR4外與已知的常見其它受體dectin-1和TLR2的結(jié)合情況。
　　3.MP-A作用于活化的THP-1巨噬細(xì)胞TLR4受體的藥理學(xué)效應(yīng)及機(jī)制的研究
　　以人T

11、HP-1細(xì)胞作為體外實(shí)驗(yàn)體系，以LPS誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞作為炎癥模型，采用CCK-8試劑盒檢測測MP-A對(duì)其增殖或者毒性作用。主要試驗(yàn)方法包括:流式細(xì)胞儀檢測THP-1細(xì)胞吞噬FITC-dextran實(shí)驗(yàn)來分析MP-A對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響;Griess試劑法測定THP-1細(xì)胞經(jīng)MP-A作用后產(chǎn)生NO的水平變化;ELISA試劑盒測定MP-A對(duì)THP-1細(xì)胞分泌TNF-α和PGE2的影響;此外采用Western blot實(shí)驗(yàn)考察了

12、MP-A對(duì)LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞iNOS、COX-2蛋白以及MAPKs和NF-κB途徑相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，同時(shí)用免疫熒光檢測了MP-A對(duì)NF-κB的核轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，運(yùn)用SPR技術(shù)分析MP-A與重組TLR4、dectin-1和TLR2的結(jié)合情況。
　　研究結(jié)果：
　　實(shí)驗(yàn)證明，兩者均具有免疫調(diào)節(jié)活性，能夠下調(diào)活化的巨噬細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)。通過使用表面離子共振技術(shù)(SPR)考察了2種多糖與細(xì)胞表面已知的受體Dectin-1，

13、TLR4和TLR2的親和力，并確證了TLR4是介導(dǎo)這2種多糖的受體。
　　1.體外實(shí)驗(yàn)表明XG和MP-A均具有免疫調(diào)節(jié)活性，能夠下調(diào)LPS活化的炎癥因子NO、TNF-α、白介素(IL)或前列腺素2(PGE2)等的表達(dá)。同時(shí)XG和MP-A具有增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬FITC-dextin功能的作用，表現(xiàn)出一定的免疫原性。暗示了XG和MP-A可能具有雙向調(diào)控的作用，同時(shí)說明炎癥因子和吞噬功能可能是由不同的機(jī)制引起。
　　2.初步確定了X

14、G和MP-A均可并由胞外TLR4受體識(shí)別，通過調(diào)節(jié)下游的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)的磷酸化與核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化和核移位等方式完成胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)而發(fā)揮藥理學(xué)作用。
　　3.XG和MP-A下調(diào)活化的巨噬細(xì)胞炎癥因子，同時(shí)可以抑制TLR4通路中的MAPK和NF-κB相關(guān)蛋白，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗炎活性，可用于炎性疾病治療藥物的開發(fā)。認(rèn)為XG和MP-A可通過與LPS競爭

15、性結(jié)合TLR4蛋白，抑制了TLR4下游胞內(nèi)信號(hào)主要是MAPK通路中的ERK和JNK蛋白的磷酸化而發(fā)揮抗炎的功能。這與研究報(bào)道的另外兩種β-葡聚糖LNT-S和BBG結(jié)果一致，暗示了D-葡聚糖結(jié)構(gòu)可能是其生物學(xué)活性的必需基團(tuán)。
　　研究結(jié)論：
　　1.本文首次研究了XG和MP-A體外免疫調(diào)節(jié)活性，研究了它們對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，吞噬功能，以及胞內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
　　2.首次通過SPR技術(shù)研究了XG和MP-A分別和