腹腔注射地米那嗪對(duì)大鼠局灶性腦缺血-再灌注早期損傷的影響及機(jī)制.pdf

1、急性缺血性卒中后功能障礙給社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成了嚴(yán)重負(fù)擔(dān)。及時(shí)開(kāi)通閉塞的血管是有效的治療方法。然而即使經(jīng)過(guò)嚴(yán)格篩選，僅12～34％的患者可但復(fù)流腦組織的進(jìn)行性損傷卻是大量患者存在持續(xù)的神經(jīng)功能缺損。隨著早期再通治療的逐步推廣，根據(jù)疾病發(fā)展規(guī)律有針對(duì)性地尋找減輕再通治療后腦組織缺血/再灌注損傷的方法是進(jìn)一步降低缺血性卒中相關(guān)殘障的重要任務(wù)。
　　血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)普遍存在于機(jī)體組織，是介導(dǎo)氧化應(yīng)激、促進(jìn)炎癥反

2、應(yīng)的重要物質(zhì)。AngⅡ高表達(dá)小鼠腦缺血/再灌注損傷程度更為嚴(yán)重;阻斷血管緊張素1型受體可減輕腦缺血/再灌注損傷。這些證據(jù)均表明血管緊張素系統(tǒng)可能在腦梗死病理生理過(guò)程中具有重要作用。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(Angiotensin converting enzyme2，ACE2)可將AngⅡ轉(zhuǎn)化為在功能上與之拮抗的血管緊張素1-7(Ang(1-7))，被認(rèn)為對(duì)缺血性卒中具有保護(hù)作用。地米那嗪(Diminazene aceturate

3、，DIZE)是一種潛在的ACE2激動(dòng)劑。有研究發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)皮素誘導(dǎo)一過(guò)性局灶性腦缺血(transient focal ischemia)后對(duì)大鼠腹腔注射DIZE可顯著縮小腦梗死體積并改善神經(jīng)功能，但機(jī)制不詳。由于這種給藥途徑和給藥時(shí)間具有極高的臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值，本研究目的在于利用更符合臨床大動(dòng)脈急性閉塞再通的線(xiàn)栓模型驗(yàn)證腹腔注射DIZE對(duì)不同類(lèi)型腦缺血/再灌注早期損傷的保護(hù)作用，并初步探索可能的機(jī)制，為進(jìn)一步明確其最佳適應(yīng)證奠定基礎(chǔ)。

4、　　第一部分大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷模型的建立與評(píng)價(jià)
　　目的:通過(guò)腔內(nèi)線(xiàn)栓法構(gòu)建大鼠局灶性缺血/再灌注損傷模型，探索缺血時(shí)間與再灌注腦損傷程度及主要方式的關(guān)系。
　　方法:
　　1、缺血時(shí)間與再灌注腦組織損傷程度的關(guān)系
　　將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為兩組，分別建立大腦中動(dòng)脈-過(guò)性閉塞1小時(shí)或2小時(shí)模型，于再灌注后24小時(shí)觀察神經(jīng)功能并取材檢測(cè)如下指標(biāo):
　　(1)建模成功大鼠24小時(shí)內(nèi)死亡率;
　　(2

5、)大鼠神經(jīng)功能損傷程度評(píng)分(NSS);
　　(3)通過(guò)TTC染色評(píng)價(jià)兩組梗死體積的差異;
　　(4)通過(guò)HE染色及Tunnel染色反映腦組織病理特征;
　　2、不同缺血時(shí)間下再灌注腦組織MDA水平變化趨勢(shì)
　　將24只實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為四組，同樣建立大腦中動(dòng)脈短暫閉塞1小時(shí)或2小時(shí)模型，兩組分別于再灌注后6小時(shí)或24小時(shí)處死并取腦檢測(cè)缺血區(qū)域MDA含量;另設(shè)立空白組作為MDA基線(xiàn)水平。
　　結(jié)果:
　　

6、1、缺血時(shí)間與再灌注腦組織損傷程度的關(guān)系
　　(1)實(shí)際使用大鼠68只（7只造模失敗），缺血1小時(shí)組24小時(shí)內(nèi)無(wú)死亡，缺血2小時(shí)組中5只于24小時(shí)內(nèi)死亡，死亡率17.8％;
　　(2)缺血1小時(shí)組NSS評(píng)分顯著低于缺血2小時(shí)組(4.0[3.5，5.0] v.s.10.5[8.5，11.5]，p＜0.001);
　　(3) TTC顯示缺血1小時(shí)及2小時(shí)組梗死體積百分比分別為11.0±5.2，13.4+3.8，兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)

7、學(xué)意義;
　　(4)缺血2小時(shí)組Tunel陽(yáng)性細(xì)胞比例高于缺血1小時(shí)組;
　　2、不同缺血時(shí)間下再灌注腦組織MDA水平變化趨勢(shì)
　　缺血1小時(shí)組24小時(shí)缺血區(qū)域皮層MDA水平顯著高于6小時(shí);缺血2小時(shí)組24小時(shí)MDA水平較6小時(shí)降低。
　　結(jié)論:在本研究條件下，一過(guò)性缺血1小時(shí)/2小時(shí)模型中氧化應(yīng)激損傷發(fā)展速度存在顯著差異，缺血1小時(shí)再灌注后脂質(zhì)氧化程度高峰出現(xiàn)于再灌注第6小時(shí)后。
　　第二部分腹腔注射DI

8、ZE對(duì)大鼠腦缺血/再灌注損傷的影響
　　目的:采用不同缺血時(shí)間的大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，評(píng)價(jià)腹腔注射DIZE對(duì)再灌注腦組織損傷的影響。
　　方法:
　　1、腹腔注射DIZE對(duì)缺血1小時(shí)再灌注損傷的影響
　　將成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組:A、假手術(shù)（頸動(dòng)脈分叉部分離）;B、缺血1小時(shí)+腹腔注射生理鹽水;C、缺血1小時(shí)+腹腔注射生理DIZE1.0mg/kg;D、缺血1小時(shí)+腹腔注射生理DIZE5.0mg/kg;

9、E、缺血1小時(shí)+腹腔注射生理DIZE15.0mg/kg。以術(shù)后24小時(shí)為研究終點(diǎn)，通過(guò)NSS評(píng)分評(píng)估五組神經(jīng)功能缺損情況;通過(guò)TTC染色評(píng)價(jià)后四組梗死范圍(％)(n=10)。進(jìn)一步以保護(hù)效應(yīng)最顯著的最低劑量作為實(shí)驗(yàn)劑量，以假手術(shù)組及生理鹽水為陰性對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照;通過(guò)Tunel染色檢測(cè)缺血腦組織中不可逆損害細(xì)胞比例（n=6/組）;通過(guò)生化試劑盒檢測(cè)梗死周?chē)M織丙二醛(MDA)濃度反映氧化應(yīng)激水平（n=6/組）。
　　2、腹腔注射DI

10、ZE對(duì)缺血2小時(shí)再灌注損傷的影響
　　將成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組:A、假手術(shù)（頸動(dòng)脈分叉部分離）;B、缺血1小時(shí)+腹腔注射生理鹽水;C、缺血1小時(shí)+腹腔注射生理DIZE5.0mg/kg。以術(shù)后24小時(shí)為研究終點(diǎn)，通過(guò)NSS評(píng)分評(píng)估三組神經(jīng)功能缺損程度;通過(guò)TTC染色評(píng)價(jià)后兩組梗死范圍(％);通過(guò)檢測(cè)缺血腦組織MDA水平反映脂質(zhì)氧化程度。
　　3、腹腔注射DIZE對(duì)ACE2活性、AngⅡ及Ang(1-7)水平的影響

11、　　取空白組、缺血1小時(shí)再灌注第24小時(shí)大鼠血漿及腦組織，通過(guò)ELISA檢測(cè)腦組織及血漿ACE2活性、AngⅡ及Ang(1-7)水平(n=6)。
　　結(jié)果:
　　1、對(duì)于缺血1小時(shí)再灌注模型，腹腔注射DIZE5.0mg/kg組NSS評(píng)分及梗死范圍顯著低于生理鹽水對(duì)照組，劑量與保護(hù)效應(yīng)呈U形趨勢(shì);腹腔注射DIZE5.0mg/kg組MDA水平顯著低于生理鹽水對(duì)照組;Tunel染色顯示腹腔注射DIZE組陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著低于生理鹽水

12、對(duì)照組，且伴隨caspase3水平下降;
　　2、對(duì)于缺血2小時(shí)再灌注模型，腹腔注射DIZE5.0mg/kg組NSS評(píng)分、梗死范圍及MDA水平均未見(jiàn)與生理鹽水對(duì)照組間存在顯著差別;
　　3、從血漿濃度差異來(lái)看，DIZE組血漿Ang(1-7)濃度顯著高于生理鹽水組（1.260±0.449，0.861±0.401ng/ml，p＜0.01），其余指標(biāo)在兩組間均無(wú)顯著差異;而腦組織中DIZE處理組及生理鹽水對(duì)照組間三指標(biāo)均未見(jiàn)顯著差

13、異。
　　結(jié)論:1、再灌注時(shí)腹腔注射DIZE5.0mg/kg可減輕大鼠缺血1小時(shí)再灌注后氧化應(yīng)激程度及細(xì)胞凋亡;2、腹腔注射DIZE可顯著上調(diào)24小時(shí)血漿Ang(1-7)水平。
　　第三部分 DIZE對(duì)神經(jīng)元糖氧剝奪/再灌注后細(xì)胞凋亡的影響
　　目的:建立原代神經(jīng)元糖氧剝奪/再灌注（OGD/R）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡模型，評(píng)價(jià)DIZE是否具有ACE2非依賴(lài)性保護(hù)作用。
　　方法:
　　1、獲取、分離、培養(yǎng)新生大鼠皮層

14、原代神經(jīng)元并進(jìn)行純化，通過(guò)尼氏染色鑒定神經(jīng)元比例;
　　2、DIZE對(duì)原代神經(jīng)元OGD/R損傷的影響。將神經(jīng)元分為5組，分別予以:①正常培養(yǎng);②OGD/R+正常培養(yǎng);③OGD/R+DIZE0.1μM;④OGD/R+DIZE1.0μM;⑤OGD/R+DIZE10.0μM，于24小時(shí)后通過(guò)AnnexinⅤ-PI雙染流式細(xì)胞學(xué)評(píng)估細(xì)胞凋亡程度;通過(guò)western blot檢測(cè)各組cl-caspase3水平;每項(xiàng)指標(biāo)設(shè)置3個(gè)平行重復(fù)。