碳納米材料治療開(kāi)放骨折后感染性骨缺損及傷口疤痕的研究.pdf

1、隨著我國(guó)工業(yè)及交通的高速發(fā)展，交通事故、高處墜落等高能量損傷導(dǎo)致的開(kāi)放性骨折發(fā)病率逐年升高，而開(kāi)放性骨折后易發(fā)生骨感染。針對(duì)感染性骨缺損的一系列病理特點(diǎn)，學(xué)者們主要將其歸納為以下幾個(gè)方面1）細(xì)菌生物膜形成;2）抗生素在局部難以形成有效濃度;3）局部血運(yùn)破壞;4）骨質(zhì)再生困難。所以開(kāi)發(fā)具有抗菌及成骨雙重效能的植骨材料對(duì)于治療開(kāi)放性骨折導(dǎo)致的感染性骨缺損十分重要。另一個(gè)影響開(kāi)放性骨折患者預(yù)后的并發(fā)癥是傷口疤痕。高能量損傷導(dǎo)致的開(kāi)放性骨折中，

2、局部軟組織受損嚴(yán)重，傷口不規(guī)則;即使開(kāi)放性骨折患者的骨組織能在較長(zhǎng)的治療周期內(nèi)愈合，但是如果遺留明顯的疤痕組織，會(huì)對(duì)患者日常生活造成困擾，限制關(guān)節(jié)的活動(dòng)度，降低開(kāi)放性骨折患者術(shù)后的滿意度。防止瘢痕形成的關(guān)鍵包括以下幾個(gè)方面:抑制成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖，抑制膠原的過(guò)度沉積，促進(jìn)傷口部位的纖維組織有序生長(zhǎng)。然而現(xiàn)階段的治療手段在減少增生性瘢痕形成的效果上尚不盡人意。
　　根據(jù)開(kāi)放性骨折感染及骨缺損的治療需求，碳納米材料中的石墨烯作為植骨材

3、料的優(yōu)越性體現(xiàn)在以下方面:1、改良支架的理化性能，滿足骨填充需要;2、生物相容性及其促骨形成性能優(yōu)良;3、對(duì)干細(xì)胞增殖和成骨分化具有積極影響;4、材料本身具備一定的抗菌性能;5、具備特殊的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可作為理想的藥物載體。
　　另一方面，碳納米管作為碳納米材料的另一種存在形式，因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和豐富的表面可修飾性，已經(jīng)廣泛運(yùn)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。研究已發(fā)現(xiàn)有序排列的碳納米管可誘導(dǎo)多種細(xì)胞取向性生長(zhǎng)生長(zhǎng)。表明取向性的碳納米管(ACNTs)作為

4、組織工程支架，可控制細(xì)胞生長(zhǎng)的位置和方向。
　　本研究的目的旨在利用碳納米材料獨(dú)特的理化性質(zhì)，制備成骨性能良好且本身具備一定抗菌性能的三維復(fù)合支架，并搭載抗生素，用于開(kāi)放性骨折后感染及骨缺的治療;再者，利用碳納米材料優(yōu)良的可塑性，制備取向性的碳納米管薄膜，通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究明確其抑制瘢痕形成的效應(yīng)，并探究其機(jī)理，為碳納米材料在組織工程中的進(jìn)一步應(yīng)用提供新的思路。
　　我們通過(guò)自組裝的方法，以抗壞血酸為還原劑，合成還原型氧化石墨烯/

5、納米羥基磷灰石復(fù)合支架(RGO-nHA)，通過(guò)SEM，AFM，TEM觀察其微觀表征;通過(guò)TGA，F(xiàn)TIR等手段表征其理化性質(zhì);通過(guò)藥物體外釋放實(shí)驗(yàn)測(cè)定復(fù)合支架緩釋萬(wàn)古霉素的性能;選用L929、MC3T3細(xì)胞，評(píng)估支架對(duì)其單克隆形成和凋亡的影響;選用BMSCs細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)、熒光染色、SEM及CLSM等方法評(píng)估支架對(duì)細(xì)胞粘附增殖，細(xì)胞形態(tài)的影響;通過(guò)茜素紅染色，ALP活性檢測(cè)等手段評(píng)估載藥支架的成骨性能;通過(guò)平板菌落計(jì)數(shù)，熒光染色等手

6、段評(píng)估支架抑制細(xì)菌增殖及生物膜形成的情況;通過(guò)液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基抑菌圈實(shí)驗(yàn)評(píng)估支架的抗菌性能及其持久性;通過(guò)體外溶血實(shí)驗(yàn)，評(píng)估支架的血液相容性，并通過(guò)SEM觀察紅細(xì)胞形態(tài)變化;通過(guò)將復(fù)合支架植入小鼠皮下，觀察其在體內(nèi)吸收的情況，評(píng)估其對(duì)小鼠關(guān)鍵臟器的影響;建立新西蘭大白兔感染性骨缺損模型，將復(fù)合支架分組植入新西蘭大白兔模型局部病灶內(nèi)，通過(guò)影像學(xué)檢測(cè)、血生化、以及組織學(xué)檢測(cè)評(píng)估感染控制和骨再生情況。
　　另外，我們通過(guò)化學(xué)氣相沉

7、積法制備有序性的碳納米管陣列，制備成ACNTs薄膜，通過(guò)SEM，TEM，SAXRD等方法觀察其微觀形貌并評(píng)估其有序性;通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、EdU染色及細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)評(píng)估其對(duì)細(xì)胞增殖的影響及其細(xì)胞安全性;通過(guò)熒光染色和SEM觀察ACNTs誘導(dǎo)細(xì)胞骨架重配并定向生長(zhǎng)的情況;通過(guò)基因芯片分析，PCR、Western-blot等方法研究其抑制膠原沉積、抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞定向生長(zhǎng)的機(jī)制;運(yùn)用新西蘭大白兔增生性瘢痕模型，通過(guò)大體觀察、組織學(xué)分析等方

8、法驗(yàn)證ACNTs抑制增生性瘢痕形成的效果。
　　結(jié)果表明，所制備的RGO-nHA復(fù)合支架具備相互連通的三維多孔結(jié)構(gòu)，摻入nHA后成骨性能也得到增強(qiáng)，可促進(jìn)細(xì)胞長(zhǎng)入、促進(jìn)骨質(zhì)再生;在此復(fù)合支架上負(fù)載萬(wàn)古霉素之后，由于與石墨烯的π-π鍵合，藥物可以在初始階段實(shí)現(xiàn)較快速的釋放，然后進(jìn)行緩慢的藥物釋放，該藥物緩釋特點(diǎn)與石墨烯的固有的抗菌活性相結(jié)合之后可確?？焖僦委煾腥静⑻峁?duì)細(xì)菌的持久抑制作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證明該載藥系統(tǒng)可有效治療感染性骨缺

9、損。再者，我們通過(guò)化學(xué)氣相沉積法成功合成了ACNTs，結(jié)果表明ACNTs可有效抑制成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖，引導(dǎo)細(xì)胞的取向性生長(zhǎng)，抑制膠原沉積，而且體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)其無(wú)細(xì)胞細(xì)胞毒性。機(jī)制分析表明，ACNTs主要通過(guò)改變細(xì)胞增殖，細(xì)胞骨架、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性以及膠原分泌相關(guān)基因表達(dá)而起作用。最后，我們采用兔耳疤痕模型對(duì)其活體效應(yīng)進(jìn)行了評(píng)估，表明ACNTs可有效抑制增生性疤痕的形成。
　　以上研究利用石墨烯、碳納米管兩種碳納米材料獨(dú)特的理化及生物